İnsan karbonik anhidrazı (HCA I) geninin klonlanması, E.coli'de ekspresyonu ve Phe91Asn yönlendirilmiş mutageneziyle elde edilen mutant enzimin inhibitörlere karşı ilgisinin araştırılması

Abstract

İnsan Karbonik Anhidraz (HCA I) (Karbonat hidroliyaz E.C. 4.2.1.1) 8. kromozomun uzun kolunda lokalize olan 30kDa büyüklüğünde bir proteindir. Eritrositlerde, kolon epitelinde, göz lensi ve korneal epitelyumda bulunur. Hücre içinde çözülebilir formda sitozolde yer alan HCA I eritrositlerde hemoglobinden sonra en bol bulunan proteindir. Yüksek göz içi basıncını düsürmek amacıyla glokom hastalığının tedavisinde kullanılan sülfonamidlerin HCA II izoenziminin yanında HCA I izoenzimini de önemli ölçüde inhibe ettiği saptanmıstır. Bu nedenle arastırmamızda sülfonamidlere karsı daha az ilgili mutant HCA I enzimleri elde edilmesi planlanmıstır. Bu amaçla insan hCA I geni, RT-PCR stratejisi ile HL60 hücre hattından pGEM-T vektörüne ve daha sonra pET21a(+) ekspresyon vektörüne klonlandı. Phe91 hidrofobik rezidüsü PCR 'a dayalı yönlendirilmis mutagenez stratejisi ile daha hidrofilik olan Asn rezidüsüne dönüstürüldü. Yabani ve mutant HCA I enzimlerinin ekspresyonu E.coli 'de gerçeklestirildi. Spesifik Sefaroz-4B-L-Tirozin afinite jeli kullanılarak saflastırıldı, hidrataz aktiviteleri belirlendi. Glokom tedavisinde sıklıkla kullanılan sülfonamid ve asetozolamide karsı inhibisyonu arastırıldı. Yabani tip HCA I enziminin aksine (IC50 = 1.257x10-4M), Phe91Asn mutantı, 0.468x10-4M IC50 değeri ile sülfonamide karsı daha yüksek afinite göstermistir. Asetozolamide karsı yabani (IC50 = 1.376x 10-6M) ve mutant (IC50 =1.283x10-6M) HCA I enzimleri arasında önemli bir inhibisyon farkı tespit edilmemistir.

Human Carbonic Anhydrase (HCA I) (Carbonate hydroliyase E.C. 4.2.1.1) is a protein with 30kDa weight and situated on the long arm of chromosome 8. It presents in erythrocytes, colon ephithelium, lens of eye and corneal ephithelium. HCA I is the most abundant protein after hemoglobin in erythrocytes which is found in cytosol and has soluble form. It?s found that sulfonamides which are used in glaucoma treatment to reduce inner eye pressure in glaucoma, inhibit not only HCA II isoenzyme but also HCA I remarkably. For this aim, in this study it was planned to obtain mutant HCA I enzymes which have low affinity to sulfonamides. Therefore hCA I gene has been cloned from HL60 (Human acute myeloid leukemic cell line) by RT-PCR strategy and was cloned into pGEMT and subsequently into pET21a(+) expression vector. Phe91 hydrophobic residue was changed into more hidrophilic Asn residue with PCR based site directed mutagenesis. The expression of wild type and mutant HCA I enzymes was performed in E.coli. Wild and mutant HCA I enzymes were purified by specific Sepharose 4B-L-Tyrosine affinity gel and hydratase and esterase activities measured. Inhibition manner of these enzymes by Sulphonilamide and acetozolamide widely used for the treatment of glaucoma was investigated. Phe91Asn mutant (IC50 =0.468x10-5M) has higher inhibition affinity than wild type HCA I with IC50 values of IC50 = 1.257x10-5M to sulphonilamide. It wasn?t defined important inhibition difference of wild type (IC50 = 1.376x 10-6M) and Phe91Asn mutant enzyme (IC50 =1.283x10-6M) to acetozolamide.