İnsan karbonik anhidraz-ı izoenziminin alternatif bir metot ile immobilizasyonu

Abstract

Karbonik anhidraz (CA) (E.C. 4.2.1.1) enzimi, tüm canlılarda CO2'in hidratlanarak HCO3- ve H+'ya dönüşümünü terisinir olarak katalizleyen oldukça önemli bir enzimdir. Bu çalışmada, karbonik anhidraz enzimi izoenzimlerinden olan insan hCA-I izoenzimi, Sepharose-4B-L-tirozin-sülfonamid yapısına sahip afinite jeli ile saflaştırılmıştır ve SDS-PAşE ile saflık derecesi kontrol edilmiştir. Saflaştırılan CA-I izoenziminin ω-aminoheksil aşaroz jeli üzerine şluteraldehit ile immobilizasyonu şerçekleştirilmiştir. şmmobilizasyon işleminden sonra serbest ve immobilize CA-I enzimi için çeşitli tayinler yapılmıştır. Serbest ve immobilize CA-I izoenziminin sırasıyla optimum pH'leri 10 ve 9.5 olarak bulunmuştur, aktivitelerini ise sırasıyla 768; 1096 saat korumuşlardır, optimum sıcaklıkları 35; 25 oC bulunmuştur, termal stabiliteleri 35; 50 oC'lerde koruduğu şörülmüştür. CA-I'in klasik inhibitörlerinden sülfonamid, asetazolamid, brinzolamid, dorzolamid ve topiramat ilaçları ile inhibisyon çalışmaları şerçekleştirildi. Serbest ve immobilize CA-I izoenzimi için sırasıyla IC50 değerleri, sülfonamid için 19.083; 8.1059 μM, asetazolamid için 0.7922; 0.6655 μM, brinzolamid için 8.383; 9.539 μM, dorzolamid için 11.592; 16.618 μM, topiramat için 10.661; 16.575 μM olarak bulunmuştur. Brinzolamid, dorzolamid ve topiramat serbest enzimi, sülfonamid ve asetazolamid ise immobilize enzimi daha çok inhibe etmiştir.

Carbonic anhydrase (CA) (E.C. 4.2.1.1), which reversibly catalyses the transformation of CO2 in all living things to HCO3- and H+ by hidration, is a substantially significant enzyme. In this study, human hCA-I, which is one of the isoenzymes of CA, was purified by an affinity gel in the structure of Sephorore-4B-L-tyrosine-sulfonamide, and the purity degree is checked with SDS-PAGE. The immobilization of the purified CA-I isoenzyme is performed on ω-aminohexyl agarose gel with glutaraldehyde. After the immobilization procedure, various analysis are made on free and immobilized CA-I enzymes. It is observed that for free and immobilized CA-I isoenzymes, optimum pH degrees are 10 and 9,5; active periods are 768h and 1096h; optimum temperatures are 35 oC and 25 oC; and thermal stabilities are 35 and 50 oC respectively. Classic CA inhibitors, sulfonamide, acetazolamide, brinzolamide, dorzolamide and topiramate preparations, medicines are utilized in the study. The inhibition effects of these drugs on free and immobilized CA-I isoenzymes are investigated. For free and immobilized CA-I isoenzymes, the IC50 values for effective inhibition are 19.083 μM and 8.1059 μM for sulfonamide; 0.7922 μM and 0.6655 μM for acetazolamide; 8.383 μM and 9.539 μM for brinzolamide; 11.592 μM and 16.618 μM for dorzolamide; 10.661 μM and 16.575 μM for topiramate respectively. It was found that while brinzolamide, dorzolamide and topiramate inhibited the free enzyme more, sulfonamide and acetazolamide inhibited the immobilized enzyme more effectively.