Ksantin oksidaz enziminin saflaştırılması ve gluteraldehit ile immobilizasyonu

Abstract

Ksantin oksidaz, pürin metabolizmasında anahtar role sahip molibden içeren bir flavoproteindir. NAD+'nın rejenerasyonu, demir absorpsiyonu ve mobilizasyonu, nitratların indirgenmesi gibi biyolojik fonksiyonlara sahiptir.Bu çalışmada ksantin oksidaz enzimi afinite kromatografisi tekniğine göre Arslan O. tarafından sentezlenen Sepharose-4B-L-tirozin-4-aminobenzamidin dihidroklorür jeli ile saflaştırılmış ve gluteraldehit üzerine immobilizasyonu edilmiştir. Amonyum sülfat çöktürmesi ve afinite kromatografisi ile saflaştırılan ksantin oksidaz enzimi %11.5 verimle ve 694.04 saflaştırma derecesi ile elde edilmiştir. Enzimin saflığı SDS poliakrilamid jel elektroforezi ile kontrol edilmiş ve 150 kDa civarında tek bant gözlenmiştir. Ksantin oksidaz enziminin kinetik sabitleri (KM ve Vmax ) ksantin bileşiği substrat olarak kullanılarak belirlenmiştir ve Lineweaver-Burk grafiğinden elde edilen KM ve Vmax değerleri sırasıyla 1.67x10-4 M ve 0.56 U/ml.dak olarak bulunmuştur. NH4F, NH4Cl, CaCl2, ZnCl2, HgCl2 ve Hg(NO3)2.H2O bileşiklerinin ve klinikte gut hastalığının tedavisinde yaygın olarak kullanılan kolşisin, ksantin oksidaz enzimi üzerindeki in vitro etkileri araştırıldığında, sırasıyla 1.42x10-4 mg/mL, 1.25x10-4 mg/mL, 0.99x10-4 mg/mL, 1.07x10-4 mg/mL, kolşisinin ise 0.27x10-4 mg/mL IC50 değerleri bulunmuştur. HgCl2 ve Hg(NO3)2.H2O bileşikleri substrat ve enzim varlığında çökelek oluşturduğundan dolayı IC50 değerleri saptanamamıştır. Enzim farklı glutaraldehit yüzdelerinde immobilize edilmiş ve enzim aktivitesi en fazla % 6 gluteraldehit oranında immobilize edilen enzimde gözlenmiştir. İmmobilize enzimin kinetik sabitleri, ksantin bileşiği substrat olarak kullanılarak Lineweaver-Burk grafiğinden elde edilmiştir. KM ve Vmax değerleri sırasıyla 5.18x10-4 M ve 0.73 U/ml.dak olarak bulunmuştur ve bu değerler, serbest enzimin katalitik etkinliğinin immobilize enzime göre daha fazla olduğunu göstermiştir.

Xanthine oxidase, a flavoprotein containing molybdenum have a key role in the metabolism of purines. It has some biological functions such as the NAD + regeneration, iron absorption, mobilization and reduction of nitrates.In this study, the enzyme xanthine oxidase was purified by Sepharose-4B-L-tyrosine-4-aminobenzamide dihydrochloride. This gel synthesized by Arslan O. according to affinity chromatography technique. Xanthine Oxidase was purified and immobilization on glutaraldehyde was investigated.Xanthine oxidase enzyme kinetic constants (KM and Vmax) were determined by using the xanthine compound as substrate. KM and Vmax values obtained from the Lineweaver-Burk graph were 1.67x10-4 M and 0.56 U/ml.min respectively.Xanthine oxidase which was purified by ammonium sulfate precipitation and affinity chromatography was obtained with 11.5% yield and 643.04 degree of purification. Purity of the enzyme was checked by SDS polyacrylamide gel electrophoresis and a single band was observed around 150 kDa. In vitro effects of NH4F, NH4Cl, CaCl2, ZnCl2, HgCl2 and Hg (NO3) 2.H2O compounds and colchicine which is widely used in the clinic for treatment of gout, on xanthine oxidase enzyme were investigated and IC50 values were 1,42x10-4 mg/mL, 1,25x10-4 mg/mL, 0,99x10-4 mg/mL, 1,07x10-4 mg/mL, 0,27x10-4 mg/mL respectively. HgCl2 and Hg(NO3)2.H2O compounds since these produce precipitate in the presence of substrate and enzyme IC50 values could not be detected. The enzyme was immobilized on different percentages of glutaraldehyde and maximum enzyme activity of the immobilized enzyme was observed in the rate of 6% glutaraldehyde. Immobilized enzyme's kinetic constants were obtained from Lineweaver-Burk graph using xanthine compound as substrate. KM and Vmax values were found to be 5.18 x10-4 M and 0.73 U / mL.min respectively and free enzyme's catalytic activity was higher than immobilized enzymes.