Katı substrat fermentasyonu (KSF) ile trichoderma harzianum ve trichoderma viride türü funguslarda ksilanaz üretimi, saflaştırılması ve biyokimyasal özelliklerin belirlenmesi

Abstract

Bu çalışmada, Katı Substrat Fermentasyon (KSF) kültür ortamında geliştirilen Trichoderma harzianum NRRL 13019 ve Trichoderma viride NRRL 6418’den ß-ksilosidaz enzimi saflaştırılmış ve biyokimyasal karakterizasyonu yapılmıştır. Birçok biyoteknolojik uygulamalarda ticari öneme sahip, ß-ksilosidaz enzimi, KSF ortamında substrat olarak buğday kepeğinin kullanılmasıyla geliştirilen Trichoderma harzianum (KSF ortamının nemlendirme sıvısı pH 4,0 Sitrik asit monohidrat (C6H8O7H2O), optimum sıcaklık 35oC ve inkübasyon süresi 7 gün) ve Trichoderma viride (KSF ortamının nemlendirme sıvısı pH 8,5 Di-sodyum hidrojen fosfat dihidrat (Na2HPO4.2H2O) tamponu ile nemlendirilerek, optimum sıcaklık 25oC ve inkübasyon süresi 7 gün) suşlarından elde edilmiştir. ß-ksilosidaz enzimi, amonyum sülfat çöktürmesi ve Sepharose-4B-L-Tyrosine-1-Napthylamine kullanılarak Hidrofobik Etkileşim Kromatografisi ile iki basamakta saflaştırılmıştır. Saflaştırılan ß-ksilosidaz enzim aktivitesi, p-nitrofenil-ß-D-ksilopiranosit (pNPX) substratı kullanılarak belirlenmiştir. Trichoderma harzianum ß-ksilosidaz enzimi (Thß) %50,48 verimle 215,76 kat; Trichoderma viride ß-ksilosidaz (Tvß) ise %33,43 verimle 92,39 kat saflaştırılmıştır. SDS-PAGE ve Native-PAGE ile Thß ve Tvß enzimlerinin molekül ağırlıkları sırasıyla 20 kDa ve 25 kDa olarak belirlenmiş olup tek alt üniteden oluştukları tespit edilmiştir. Thß ve Tvß enzimlerinin optimum pH değerleri 6,0; optimum sıcaklık değerleri ise sırasıyla 75°C ve 65°C olarak saptanmıştır. Thß enzimin Km ve Vmax değerleri sırasıyla 0,25 mM ve 2500 EU; Tvß enziminin ise 0,5 mM ve 2500 EU olarak belirlenmiştir. Ayrıca saflaştırılan ß- ksilosidaz enzimlerinin aktiviteleri bir ß-ksilosidaz inhibitörü olan D-(+)-ksiloza karşı belirlenmiştir. D-(+)-ksiloz inhibitörünün Thß enzimini karışık, Tvß enzimini ise yarışmalı olarak inhibe ettiği belirlenmiştir. D-(+)-ksilozun Thß enzim aktivitesi üzerine IC50 ve Ki değerleri sırasıyla 1,1x10-1 mM ve 1,10x10-3/5,57x10-3; Tvß enziminin IC50 ve Ki değerleri ise 7,1x10-2 mM ve 2,64x10-4±1x10-5 olarak hesaplanmıştır.

In this study, purification and biochemical characterization of ß-xylosidase enzyme purified from Trichoderma harzianum NRRL 13019 and Trichoderma viride NRRL 6418 growth in solid state fermentation (SSF) was performed. ß-xylosidase enzyme that has many biotechnological applications, was primarily obtained from Trichoderma harzianum (SSF conditions moistening citric acid monohydrate (C6H8O7H2O) pH 4.0, temperature 35°C and incubated 7 days) and Trichoderma viride (SSF conditions moistening disodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO4.2H2O) pH 8.5, temperature 25°C and 7 days) grown in SSF using wheat bran as a substrate. ß-xylosidase enzyme was purified using two-step procedures, namely ammonium sulfate precipitation and Sepharose-4B-L-Tyrosine- 1-Napthylamine Hydrophobic Interaction Chromatography. In our study, purified ß-xylosidase enzyme activity was determined by using para-Nitrophenyl-beta-D-xylopyranoside (pNPX) substrate. The purification rate was found 215.76 fold with yield of 50.48% for the obtained ß-xylosidase from Trichoderma harzianum (Thß) and 92.39, 33.43% yield for the obtained ß-xylosidase from Trichoderma viride (Tvß). Molecular weights of Thß and Tvß enzymes were determined 20kDa and 25kDa, respectively, using SDS and Native PAGE analysis, and are formed in sub-unit. Optimum pH values of Thß and Tvß enzymes were 6.0; respectively, optimum temprature values were determined as 75°C and 65°C. The Km and Vmax values of Thß enzyme were determined as 0.25 mM and 2500 EU, respectively; while for the Tvß enzyme 0.5 mM and 2500 EU. In addition, the activities of purified ß-xylosidase enzymes were determined against D-(+)-xylose which is a ß-xylosidase inhibitor. It is determined that D-(+)-xylose inhibitor inhibited the Thß enzyme mixed and the Tvß enzyme competitively. The IC50 and Ki values for D-(+)-xylose Thß enzyme activity were calculated according to an order as 1.1x10-1 mM and 1.10x10-3/5.57x10-3; respectively IC50 and Ki values of Tvß enzyme as 7.1x10-2 mM and 2.64x10-4±1x10-5.