İnsan eritrositlerinden glukoz 6-fosfat dehidrogenaz enziminin saflaştırılması, bazı kumarin ve pestisitlerin etkilerinin araştırılması

Abstract

Bu çalışmada genel metabolizma için çok önemli yere sahip olan Glukoz 6-fosfat dehidrogenaz (D-glukoz-6-fosfat: NADP+ oksidoredüktaz, EC 1.1.1.49; G6PD) enzimi insan eritrositlerinden saflaştırıldı ve karakterize edildi. Saflaştırma işlemi, amonyum sülfat çöktürmesi ve 2', 5' ADP-Sepharose 4B afinite kromatografisi olarak iki basamakta gerçekleştirildi. İnsan eritrosit G6PD enzimi %33,65 verimle 7068,100 kat saflaştırıldı. Sodyum dodesilsülfat poliakrilamid jel (SDS-PAGE) elektroforezi ile G6PD enziminin molekül ağırlığı yaklaşık 59000-60000 dalton arasında olduğu belirlendi. G6PD enziminin NADP+ ve glukoz 6-fosfat (G6P) substratları için Km ve Vmax değerleri belirlendi. Enzim aktiviteleri spektrofotometrik olarak 340 nm'de Beutler metoduna göre ölçüldü. Beslenme ve tedavi süreçlerinde insan vücudu ile etkileşim içerisinde bulunabilecek altısı yeni yedi kumarin türevi ve üçü herbisit ikisi insektisit beş pestisitin enzim aktivitesi üzerine in vitro etkileri incelendi. Kumarin bileşiklerinin isimleri, 6,7-dihidroksi-3-(2-metilfenil)-2H-kromen-2-on (OPC), 6,7-dihidroksi-3-(3 metilfenil)-2H-kromen-2-on (MPC), 6,7-dihidroksi-3-(4-metilfenil)-2H-kromen-2-on (PPC) ,6,7dihidroksi-3-(2,5dimetoksifenil)-2H-kromen-2-on (DPC), 6,7-dihidroksi-3-(3,4,5-trimetoksifenil)-2H-kromen-2-on (TPC), 7,8-dihidroksi-3-(4-metilfenil)-2H-kromen-2-on (FPC), Varfarin sodyum'dur. Varfarin sodyum hariç kumarin bileşiklerinin tamamı G6PD enzimi aktivitesi üzerine inhibisyon etkisi gösterdi. Kumarin bileşikleri içinde en etkili inbitörün OPC olduğu belirlendi. Kumarin bileşiklerinin inhibisyon mekanizmaları yarışmalı, yarı yarışmalı, yarışmasız ve karışık tipte olarak tespit edildi. Çalışmada incelenen pestisitler glifosat, deltamethrin, 2,4-D, diazinon, imazethapyr'dir. Pestisitlerin tamamımın enzim aktivitesi üzerine inhibisyon etkisi gösterdiği belirlenmiştir. İnhibisyon mekanizmalarının yarı yarışmalı ve yarışmalı tipte olduğu tespit edilmiştir.

In this study, Glucose 6-phosphate dehydrogenase (D-glukoz-6-fosfat: NADP+ oksidoreductase, EC 1.1.1.49; G6PD) enzyme which is very important for general metabolism was purified from human erythrocytes and characterized. The purification prosess consists of two steps; ammonium sulfate fractionation and 2' 5'ADP-Sepharose 4B affinity chromatography. Human erythrocyte G6PD enzyme was purified 7068,100 fold in a yield of 33,65 %. Molecular weight of G6PD enzyme were determined approximately between 59000-60000 dalton by sodyum dodesilsulfate polyacrylamide gel (SDS-PAGE) elektrophoresis. Km and Vmax values for NADP+ and glucose 6-phosphate (G6P) substrates of G6PD enzyme were determined. Enzymatic activity was spectrofotometrically measured according to Beutler method at 340 nm. In vitro effects of six new coumarin derivatives of seven; three herbisite and two insectisites that may be in interaction with human body throughout nutrition and medical treatment, on enzyme activities were investigated. The name of coumarins are 6,7-dihydroxy-3-(2-methylphenyl)-2H-chromen-2-one (OPC), 6,7-dihydroxy-3-(3-methylphenyl)-2H-chromen-2-one (MPC), 6,7-dihydroxy-3-(4-methylphenyl)-2H-chromen-2-one (PPC), 6,7dihydroxy-3-(2,5-dimethoxyphenyl)-2H-chromen-2-one (DPC), 6,7-dihydroxy-3-(3,4,5-trimethoxyphenyl)-2H-chromen-2-one (TPC), 7,8-dihydroxy-3-(4-methylphenyl)-2H-chromen-2-one (FPC), Varfarin sodium. Except of Varfarin sodium , all of them caused an inhibition effect on G6PD enzyme activity. It was found that OPC is the most effective inhibitor in coumarin compounds. Inhibiton mechanism of coumarin derivatives were determined as competitive, uncompetitive, noncompetitive and mixed types. Investigated pesticides in this study are gliphosate, deltamethrin, 2,4-D, diazinon, imazethapyr. All of them indicated the inhibitory effects on the enzyme activity. Inhibition mechanism of them were determined as uncompetitative and compatitative.