Anjiogenezis etkili faktörlerin karbonik anhidraz IX Gen ekspresyonuna etkilerinin belirlenmesi

Abstract

Karbonik Anhidraz IX katı tümörlü hücrelerde ifadesi olan Karbonik Anhidraz ailesinin bir üyesidir. CAIX'un ekspresyonu bir çok kanser türünde hastalık süreci ile ilişkilidir. Kanser ile ilişkili olan CAIX geninin regülasyonunun aydınlatılması, kanser tanı ve tedavisi için yeni bir yaklaşım olacaktır. VEGF anjiogenez olayının regülasyonunda anahtar role sahip bir sitokindir. Bu anlamda CAIX ve VEGF'in hipoksiyaya yanıtta indüklenebildiği bilinmekle beraber, VEGF'in CAIX un ekspresyonunu etkileyip etkilemediği konusunda ayrıntılı bilgi yoktur. Bu çalışmada, farklı sitokinlerin VEGF165, TNF-α ve TGF-β karaciğer kanser hücreleri üzerindeki proliferatif etkileri hem normal oksijen koşullarında hemde düşük oksijen koşullarında MTT testi ile değerlendirildi. Kimyasal indüklenmiş hipoksi modeli HIF1α mRNA seviyesinde doğrulandı. CAIX ve CAXII'nin hipoksik koşullar altında indüklendiği mRNA seviyesinde belirlendi. Daha sonra VEGF sitokini hem normal oksijen hemde hipoksik koşullarda, farklı zaman aralıklarında uygulandı. VEGF hem normal oksijen koşullarında, hem de hipoksik koşullar altında CAIX mRNA düzeyinde artışa neden oduğu gerçek zamanlı PZR analizi ile gösterildi. Aynı artış akış sitometri analizi ile protein düzeyinde doğrulandı. VEGF etkisi, karaciğer hücreleri haricinde farklı doku modelinde, osteosarkom hücrelerinde de gösterildi. Saos-2 hücrelerinde VEGF'in CAIX artış etkisi, gerçek zamanlı PZR, akış sitometrisi ve western blot analizi ile doğrulandı. Farklı osteosarkom modeli MG-63 hücrelerinde CAIX mRNA artışı devam etmiştir. Hep3B, Saos-2 ve MG-63 hücrelerinde benzer yerleşimli CAXII mRNA düzeyinde de artış belirlendi. Ayrıca farklı yolak inhibitörlerinin CAIX mRNA üzerindeki etkileri gerçek zamanlı PZR ile belirlendi.

Carbonic Anhydrase IX expressed in solid tumor cell is a member of the carbonic anhydrase family. CAIX expression in many cancer types is associated with disease processes. Elucidation of CAIX regulation associated with cancer would be a new approach in cancer treatment. VEGF is a cytokine that plays a key role in the regulation of angiogenesis. In this sense, although CAIX and VEGF is inducible in response to hypoxia, there is no detailed information about the effect of VEGF of the expression of CAIX. In this study, the proliferative effect of different cytokines, VEGF165, TNF-α and TGF-β, on liver cancer cells in normal and low oxygen conditions were evaluated by MTT assay. Chemically induced hypoxic conditions was confirmed the mRNA level of HIF1α. The fact that CAIX and CAXII could be induced under hypoxic conditions was determined at the mRNA level. Then, VEGF was applied in both normal and hypoxic conditions at different time intervals. Real-time PCR analysis demonstrated that VEGF causes an increase in CAIX mRNA level in both normal oxygen and hypoxic conditions. The same increase at the protein level analysis was confirmed by flow cytometry. VEGF effect was also demonstrated in different tissue model, asteosarcoma cells as well as Hep3B cells. Upregulation of CAIX gene with VEGF was confirmed by real time PCR, flow cytometry and western blot in Saos-2 cells. The VEGF dependent CAIX expression was still in the increase in the second osteosarcoma model, MG-63. VEGF upregulates CAXII mRNA expression that is another membrane located CA isoform in Hep3B, Saos-2 and MG-63 cells. Different inhibitors that blocks the patways on CAIX mRNA level was also determined by real time PCR.