Rhodobacter capsulatus bakterisinde sitokrom c oksidaz mutantlarının eldesi ve karakterizasyonu

Abstract

Fakültatif fototrof Rhodobacter capsulatus bakterisi sadece cbb3-tip olarak tanımlanmış sitokrom c oksidaz enzimine sahiptir. Sitokrom cbb3 oksidaz enzimini kodlayan yapısal genler (ccoNOQP) klonlanarak karakterize edilmiştir. NADF fenotipi veren bazı biyogenesiz genleri (ccoNOQP ve ccoGHIS) tanımlanmıştır. Önceden elde edilmiş NADI mutantlarının karakterizasyonu, bugüne kadar tanımlanan sitokrom cbb3 oksidaz biyogenesiz genlerinin dışında başka genlerin de varlığını göstermiştir. Bu çalışmada, sitokrom cbb3 oksidaz enziminin biyogenezinden sorumlu bugüne kadar tanımlanmamış yeni genlerin tanımlanması için, cbb3-tip oksidazın yapısal genlerini hem kromozomunda hem de plasmidinde taşıyan R. capsulatus MT1131/pOX15 yaban suşu kimyasal yöntemle mutasyona uğratıldı. Random mutasyona uğrayan kolonilerden sitokrom cbb3 oksidaz aktivitesi etkilenen mutant bakteriler, NADI reaksiyonu ile seçildi. Böylece NADI reaksiyonunu gerçekleştiremeyen, NADI- fenotipinde yeni AYG mutantları elde edildi. AYG mutantları, besi ortamına bağlı farklı fotosentetik büyüme özellikleri gösterdiler. Mutantların Schâgger-tip SDS-PAGE ve TMBZ boyama ile kromatofor membranlarındaki sitokrom c profilleri incelendiğinde sitokrom c profilleri bugüne kadar elde edilen mutant profillerinden önemli farklar gösterdi. Solunumla büyüyen AYG mutantlarının kromatoforlarında sitokrom cbb3 oksidazın co altünitesinin bulunmasına rağmen, cp altünitesine rastlanmadı. AYG mutantları aktif sitokrom cbb3 oksidazın sentez ve biyogenesizi için gerekliliği bilinen genlerle {ccoNOQP, ccoGHIS) komplement etmedi. Kromozomal DNA kütüphanesi ile yapılan krosslarla NADI+ fenotipi sağlayan 7 kb lik BamHl parçası taşıyan yeni bir plasmid (pAYl) elde edildi. AYG mutantları önceden elde edilmiş mutantlarla (MR2 ve IJ1), pAYl plasmidi de bu mutantları komplement etmiş olan plasmidlerle (pMRB, pMRC) karşılaştırıldı. Komplementasyon deneyleri AYG mutantları ile MR2 mutantının benzer genlerle komplement ettiğini gösterdi. Her iki plasmid de (pMRB ve pAYl) proA ve plsC genleri ile bunlar arasında henüz fonksiyonları tanımlanmış protein kodlayıcı diziler içermekte olup, bu genler hem AYG hem de MR2 mutantlarını komplement etmektedir.

The facultative phototrophic bacterium Rhodobacter capsulatus contains only one type cytochrome c oxidase, which has been identified as cbb3-type. The structural genes (ccoNOQP) encoding cytochrome cbb3 oxidase have been cloned and characterized. Several cbb3, biogenesis genes (ccoNOQP and ccoGHIS) resulting in the NADI phenotype had been identified. Characterization of previous NADI mutants indicated the presence of other cytochrome cbbi biogenesis genes in addition to already identified genes. In this work. R. capsulatus strain MT1131/pOX15 carrying ccoNOQP on both the chromosome and pOX15 plasmid, was mutated by chemical methods in order to identify new genes responsible for the activitation of cbb3, oxidase enzyme. The random mutated colonies showing the affected activity of cytochrome cbb3 oxidase were selected by NADI reaction. The novel AYG mutants which can not produce NADI reaction and have NADI phenotypes were obtained. AYG mutants exhibited medium-dependet photosynthetic growth features. When cytochrome c profile in chromotophore membranes of mutants were analyzed with Schâgger-type SDS-PAGE and TMBZ staining they showed significant differences in their cytchrome c profile from the other mutants obtained so far. From c-type cytochromes of cytochrome cbb3 oxidase, the cp was missing while co was present in aerobically growing AYG mutants. AYG mutants were not complemented with known genes (ccoNOQP, ccoGHIS and ccoNOQPGHIS) that are required for the synthesis and biogenesis of an active cytochrome cbb3 oxidase. From chromosomal DNA library, a new plasmid (pAYl) containing the 7 kb BamHI chromosomal fragment providing NADI+ phenotype was obtained. Both AYG mutants and the pAYl plasmid were compared with previously obtained mutants (MR2 and IJ1) and their complementing plasmids (pMRB and pAY1). Complementation experiments revealed that AYG and MR2 mutants are being complemented with a similar gene cluster. Both pAY1 and pMRB plasmids carry similar genes including proA and plsC genes which are complemented both AYG and MR2 mutants.