Farklı koyun ırklarından karbonik anhidraz enziminin saflaştırılması ve bazı pestisitlerin enzim üzerine etkilerinin araştırılması

Abstract

Bu çalışmada, canlıların yapısında son derece önemli fizyolojik role sahip karbonik anhidraz (CA, E.C.4.2.1.1) enziminin Dorset Down, Merinos, Kıvırcık koyun kan eritrositlerinden saflaştırılmıştır ve bazı pestisitlerin enzim üzerine inhibisyon etkileri araştırılmıştır. Karbonik anhidraz enzimi, Sepharose - 4B - etilendiamin - 4-izotiyosiyanat benzen sülfonamid jeli kullanılarak afinite kromatografisi tekniği ile saflaştırılmıştır. Enzim için %verim ve saflaştırma dereceleri sırasıyla Dorset down ırkı için %22.48 verim ve 320.5 kat, Kıvırcık ırkı için % 28.3 verim ve 182.66 kat ve Merinos ırkı için %16.79 verim ve 69.1 kat saflaştırıldığı bulunmuştur. Enzim saflığı kontrolü Sodyum Dodesil Sülfat Poliakrilamid Jel Elektroforezi (SDS-PAGE) ile kontrol edilerek üç koyun türü için de enzimin moleküler ağırlığı yaklaşık 29 kDa olarak tespit edilmiştir. Dorset down, Kıvırcık ve Merinos CA enziminin fenil asetat substratına karşı Km ve Vmax değerleri belirlenmiştir. Dorset Down, Merinos, Kıvırcık CA enzimi Km ve Vmax değerleri sırasıyla 0.007 µM, 0.116 U/mLdk, 0.015 µM, 0.443 U/mLdk, 0.015 µM, 0.443 U/mLdk olarak bulunmuştur. Bu çalışmada kullanılan pestisitler karbonik anhidraz enzimini in vitro olarak farklı düzeylerde inhibe ettiği tespit edilmiştir. Dorset Down CA enzimi için en güçlü inhibitör Karbofuran (IC50: 4.90 µM) ve en zayıf inhibitör Klorpirifos – Metil’dir (IC50: 126.42 µM). Kıvırcık CA enzimi için en güçlü inhibitör Amitraz (IC50: 26.23 µM) ve en zayıf inhibitör Koumatetralil (IC50: 61.45 µM) iken Merinos CA enzimi için en güçlü inhibitör Karbofuran (IC50: 5.78 µM) ve en zayıf inhibitör ise Diklofluanid'dir (IC50: 62.05 µM).

In this study, carbonic anhydrase (CA, E.C.4.2.1.1) enzyme, which has an extremely important physiological role in the structure of living things, was purified from Dorset Down, Merino, and Kivircik sheep blood erythrocytes and the inhibition effects of some pesticides on the enzyme were investigated. Carbonic anhydrase enzyme was purified by affinity chromatography technique using Sepharose – 4B – ethylenediamine – 4 –isothiocyanate benzene sulfonamide gel. The yield and purification degrees for the enzyme were found to be 22.48% yield and 320.5 times for the Dorset down breed, 28.3% yield and 182.66 times for the Kıvırcık breed, and 16.79% yield and 69.1 times for the Merino breed, respectively. Enzyme purity was checked by Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE), and the molecular weight of the enzyme was determined to be approximately 29 kDa for all three sheep breeds. Km and Vmax values of Dorset down, Kivircik and Merino CA enzymes were determined against phenyl acetate substrate. Dorset Down, Merino, Kivircik CA enzyme Km and Vmax values were found as 0.007 µM, 0.116 U/mL.min, 0.015 µM, 0.443 U/mL.min, 0.015 µM, 0.443 U/mL.min, respectively. The pesticides used in this study were found to inhibit the carbonic anhydrase enzyme at different levels in vitro. The strongest inhibitor for Dorset Down CA enzyme is Carbofuran (IC50: 4.90 µM) and the weakest inhibitor is Chlorpyrifos-Methyl (IC50: 126.42 µM). For the Kivircik CA enzyme, the strongest inhibitor is Amitraz (IC50: 26.23 µM) and the weakest inhibitor is Coumatetralil (IC50: 61.45 µM), while the strongest inhibitor for Merino CA enzyme is Carbofuran (IC50: 5.78 µM) and the weakest inhibitor is Diclofluanid (IC50: 62.05 µM).