İnsan PSMD4 geninin moleküler karakterizasyonu

Abstract

Ubikitin-proteazom sistemi (UPS), protein homeostazını düzenleyerek hücresel süreçlerin sağlıklı bir şekilde ilerlemesinde kritik rol oynar. PSMD4 geni, UPS’de görev alan 26S proteazomun başlıca ubikitin reseptörü olarak hizmet eden alt birimlerinden birini kodlar. Ayrıca PSMD4 geni, karboksil ucunda ek üç amino asit içeren angiosidin proteinini de kodlamaktadır. Her iki protein de çeşitli kanser tiplerinde tümör ilerlemesiyle ilişkilidir. Literatürde, PSMD4 geninin pankreas kanserindeki rolünü ortaya koyan bir çalışma bulunmamaktadır. Bu çalışmada, PSMD4 geninden yönlendirilmiş mutagenezle angiosidin geni elde edildi ve her iki gen de pEGFP-C1 vektörüne klonlandı. PSMD4 ve angiosidin genleri, PANC-1 ve HUVEC hücrelerine geçici transfeksiyonla aktarıldı. Genlerin over ekspresyonu real-time PCR, western blot, flow sitometri ve GFP analizleri ile doğrulandı. PSMD4 ve angiosidin over ekspresyonu PANC-1 ve HUVEC hücrelerinde proliferasyonunu, migrasyonunu ve koloni oluşum yeteneğini arttırmaktadır. Ek olarak over ekspresyonun EMT ve apoptoz süreçleriyle ilişkili bazı genlerin ekspresyonuna etkisi mRNA düzeyinde belirlendi. Çalışmada ayrıca PANC-1 ve HUVEC hücrelerindeki PSMD4 geninin kısmi susturulması shRNA kullanılarak gerçekleştirildi. PSMD4 gen susturulması real-time PCR ve immünofloresan analizleri ile doğrulandı. PSMD4 susturulması hücre proliferasyonunu, migrasyonunu ve koloni oluşum yeteneğini PANC-1 hücrelerinde azaltırken HUVEC hücrelerinde arttırmaktadır. Çalışmanın devamında VEGF sitokininin PANC-1 ve HUVEC hücrelerinde PSMD4 gen ekspresyonunu mRNA ve protein seviyesinde arttırdığı belirlendi. VEGF’in PSMD4 gen regülasyonunu P38 MAP kinaz, JNK, MEK ve PI3K yolakları üzerinden etkilediği mRNA ve protein düzeyinde gösterildi. Son olarak PSMD4 genine ait üç promotor parçasının PANC-1 ve HUVEC hücrelerindeki transkripsiyonel aktivitesi belirlendi. Bu tez çalışması sonucunda elde edilen bilgilerin PSMD4 genini hedef alan tedavilerin geliştirilmesine katkı sağlayacağını öngörmekteyiz.

The ubiquitin-proteasome system (UPS) plays a critical role in the healthy progression of cellular processes by regulating protein homeostasis. The PSMD4 gene encodes one of the subunits of the 26S proteasome in UPS, which serves as the major ubiquitin receptor. In addition, the PSMD4 gene encodes the angiocidin protein with an additional three amino acids at the carboxyl terminus. PSMD4 and angiocidin proteins share similar sequences and have common binding interactions. There is no study in the literature revealing the role of the PSMD4 gene in pancreatic cancer. In this study, the angiocidin gene was obtained from PSMD4 gene by directed mutagenesis and both genes were cloned into pEGFP-C1 vector. PSMD4 and angiocidin genes were transferred into PANC-1 and HUVEC cells by transient transfection. Overexpression of genes was confirmed by real-time PCR, western blot, flow cytometry, and GFP analyses. Overexpression of PSMD4 and angiocidin increases proliferation, migration and colony formation ability in PANC-1 and HUVEC cells. In addition, the effect of overexpression on the expression of some genes associated with EMT and apoptosis processes was determined at the mRNA level. Also, partial silencing of PSMD4 gene in PANC-1 and HUVEC cells was performed using shRNA. PSMD4 gene silencing was confirmed by real-time PCR and immunofluorescence analyses. PSMD4 silencing reduces cell proliferation, migration, and colony formation ability in PANC-1 cells while increasing it in HUVEC cells. In the continuation of the study, it was determined that VEGF cytokine increased PSMD4 gene expression at mRNA and protein level in PANC-1 and HUVEC cells. VEGF was shown to affect PSMD4 gene regulation via P38 MAP kinase, JNK, MEK and PI3K pathways at the mRNA and protein level. Finally, the transcriptional activity of three promoter fragments of the PSMD4 gene in PANC-1 and HUVEC cells was determined. We foresee that the information obtained as a result of this thesis study will contribute to the development of treatments targeting the PSMD4 gene.