Trichoderma atroviride'den β-glukosidaz eldesi, saflaştırılması ve biyokimyasal karakterizasyonunun belirlenmesi

Abstract

Bu çalışmada, Trichoderma atroviride NRRL 25150'den elde edilen β-glukosidaz enzimi, öğütülmüş fasulye kabuğu kullanılarak Katı Substrat Fermentasyonu (KSF) yöntemiyle üretilmiştir. Ardından elde edilen enzim, iki farklı yöntem kullanılarak saflaştırılmıştır. İlk aşamada Trichoderma atroviride'den KSF ortamında β-glukosidaz enzimi elde edilmesi için gereken optimum şartlar belirlenmiştir. Optimum ortam şartları; nemlendirme sıvısı olarak Sitrik asit monohidrat tamponu (C6H8O7), pH 5, sıcaklık 25°C ve inkübasyon süresi 4 gündür. Saflaştırdığımız β-glukosidaz'ın saflaştırma verimi ve kat sayısı sırasıyla %17,1434 ve 6,7117 kat olarak belirlenmiştir. β-glukosidazın saflığı ve alt birim varlığı/sayısının belirlenmesi için Sodyum Dodesil Sülfat-Poliakrilamid Jel elektroforez metodu uygulanmış ve enzimin yaklaşık olarak 70 kDa ve 60 kDa moleküler ağırlığında iki alt birime sahip olduğu saptanmıştır. Saflaştırılan enzimin aktivitesinin tespit edilmesinde p-nitrofenil-β-D-glukopiranosit (pNPG) kullanılarak enzimin yüksek aktivite gösterdiği sıcaklık değeri ve pH değerleri sırasıyla 65°C ve pH 3 olarak belirlenmiştir. β-glukosidaz enziminin kinetik parametreleri de çalışılmıştır. Km ve Vmax değerleri 0,0869 mM ve 434,782 EU olarak hesaplanmıştır. Buna ek olarak, β-glukosidaz enzimine δ-glukonolakton ve D(+)-glukoz inhibitörlerinin pNPG substratı bulunan ortamda karışık tipte inhibisyon etkisi gösterdiği tespit edilmiştir. δ–glukonolakton inhibitörünün Ki ve IC50 değerleri ise sırasıyla Ki(1): 0,0712x10-3 , Ki(2): 0,068x10-3 ve 8,4214 mM; D(+)-glukoz inhibitörünün Ki ve IC50 değerleri sırasıyla Ki(1): 4,31x10-3, Ki(2): 29,45x10-3 ve 9,7395 mM olarak hesaplanmıştır.

In this research, the Beta-glucosidase enzyme from Trichoderma atroviride NRRL 25150 was produced by the Solid State Fermentation (SSF) method utilizing ground bean pods. Subsequently, the enzyme obtained in this way was then purified using two different methods. The first step was the determination of the optimal conditions for the production of β-glucosidase from Trichoderma atroviride in SSF medium. Citric acid monohydrate buffer (C6H8O7) as humidifying liquid, pH 5, temperature 25°C and incubation time 4 days were considered as optimal conditions. The purification yield and the fold number of the purified β-glucosidase were determined to be 17.1434 % and 6.7117 fold, respectively. Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel electrophoresis was used to determine the purity and the presence/number of subunits of β-glucosidase and it was found that the enzyme has two subunits with molecular weights of approximately 70 kDa and 60 kDa. The activity of the purified enzyme was evaluated with the use of p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside (pNPG). The temperature and pH at which the enzyme exhibited high activity were determined to be 65°C and pH 3 respectively. The kinetic properties of β-glucosidase were also investigated. Km and Vmax were calculated as 0.0869 mM and 434.782 EU, respectively. Furthermore, δ-gluconolactone and D(+)-glucose inhibitors were found to exert mixed inhibition on β- glucosidase enzyme in the absence of pNPG substrate. Ki and IC50 of δ-gluconolactone inhibitor were calculated as Ki(1): 0.0712x10-3, Ki(2): 0.068x10-3 and 8.4214 mM; Ki and IC50 values of D(+)-glucose inhibitor were calculated as Ki(1): 4.31x10-3, Ki(2): 29.45x10-3 and 9.7395 mM, respectively.