Bazı sitokinlerin C/EBPδ geninin transkripsiyonel regulasyonu üzerine etkilerinin araştırılması

Abstract

C/EBP’ler (CCAAT/enhancer binding proteins) C-terminus’da tümüyelerinde korunmuş bir bazik lösin fermuar domaini içeren transkripsiyon faktör ailesidir. Bu domain bir DNA bağlanma ve dimerizasyon motifi oluşturmaktadır. Ailenin altı farklı üyesi, C/EBPα, C/EBPβ, C/EBPγ, C/EBPδ, C/EBPε, ve C/EBPζ olmak üzere, izole edilmiş ve karekterizasyonu yapılmıştır. C/EBP aile üyelerinden biri olan C/EBPδ hemen hemen her dokuda ekspre edilmesine rağmen seviyeleri farklılık göstermektedir. Örneğin C/EBPδ böbrek ve testislerde fazlaca ekspre olmaktadır. İnsan C/EBPδ geniş bir açık okuma dizisine sahip olan bir eksondan ibarettir. C/EBPd 269 a.a.’ten oluşan bir protein şifrelemektedir. C/EBPδ doku veya hücre tipine spesifik tarzda regüle edilmektedir. C/EBPδ interlökin-1 ( IL-1), interlökin-6 (IL-6) ve tümör nekrosis faktör-α (TNF-α) gibi inflamasyonel uyarıcılar tarafından regüle edilmektedir. C/EBPδ doku hasarları, enfeksiyon, inflamasyon ve akut faz cevapta, hücre proliferasyonunda, hücrelerde enerji metabolizmasının düzenlenmesinde ve meme epitel hücrelerinin apoptosisde önemli rol oynamaktadır. C/EBPδ gen haritası 8. (8p11.1-p11.2) kromozomdadır. Ve insan kanserlerinin çoğu kromozom 8p’de var olan mutasyonlar sebebiyle olmaktadır. Bu sebepledir ki C/EBPδ son çalışmalarda bir tümör baskılayıcı gen olarak tanımlanmıştır. Fakat çok sayıda dokulara spesifik genlerin ekspresyonlarını kontrol eden C/EBPδ’nın regülasyonu konusundaki bilgi oldukça sınırlıdır. Bu çalışmada, insan C/EBPδ geninin transkripsiyonel regülasyonunu aydınlatmayı amaçladık. Bu amaçla lüsiferaz vektörüne klonlanmış olan C/EBPδ promoteri insan hepatoma hücre hattı olan Hep3B hücrelerine kalsiyum fosfat transfeksiyon yöntemi ile aktarıldı. Geçici transfeksiyon uygulaması sonrasında, C/EBPδ promoterinin bazal aktivietsi lusiferaz aktivite tayini ile belirlendi. Daha sonra IL-6, TNF-α, TGF-β, IFN-γ ve IL-1 gibi birçok sitokinin C/EBPδ promoterinin regülasyonuna olan etkileri saptandı. Genin regülasyonunda etkileri belirlenen sitokinlerin konsantrasyon ve zaman bağlı analizleri yapıldı. Ayrıca C/EBPδ nın mRNA seviyesinde ekspresyon analizleri RT-PCR çalışmaları ile belirlendi.

CCAAT/enhancer binding proteins (C/EBPs) are a family of transcription factors that all contain a highly conserved, basic leucine zipper domain at the C-terminus. The domain consists of DNA binding and dimerization motif. The six members of the family have been isolated and characterized as C/EBPα, C/EBPδ, C/EBPγ, C/EBPβ, C/EBPε, C/EBPζ. As one of the C/EBP family members, C/EBPδ are almost ubiquitously expressed in every tissues, but with varying levels. C/EBPδ expression is most abundant in kidney and testis. The human C/EBPδ turned out to be oneexon gene with a large open reading frame encoding a protein of 269 amino acid. C/EBPδ can also be up-regulated in a tissue or cell type-specific manner. C/EBPδ, is well known to regulate or co-regulate a wide range of inflammatory mediators and mechanisms in the periphery, including interleukin-1 (IL-1), interleukin-6 (IL-6), and tumor necrosis factor-α (TNF-α). C/EBPδ also plays a role in acute-phase response in injury, infection and inflammation, cell proliferation, energy metabolism regulation and mammary epithelial cell apoptosis. The human C/EBPδ gene maps on chromosome 8 (8p11.1-p11.2). Alterations in chromosome 8p are common in human cancers. Accordingly in recent reports, alterations of C/EBPδ identified as a tumour supressor gene. However, the knowledge of the regulation of C/EBPδ that control the transcriptional regulation of a number of tissue specific genes is very limited. In this study, we aimed to elucidate the trancriptional regulation of the human C/EBPδ gene. In this purpose, C/EBPδ promoter in a luciferase vector was transfected in to human hepatoma cell line (Hep3B) with calcium phosphate transfection method. Upon the transient transfection, the basal activity of the C/EBPδ promoter was determined by luciferase activity. Afterwords, for the determination of cytokine mediated regulation of the C/EBPδ gene, several cytokines, namely IL-6, TNF-alfa, TGF-beta, IFN-gama and IL-1 were used and the effect of cytokines on the C/EBPδ gene investigated. For the cytokines which have an effect on C/EBPδ gene, concentration, time analysis were completed. Futhermore, the expression levels of C/EBPδ mRNAs were also determined with RT-PCR analysis.