Klinik ve subklinik mastitiste Staphylococcus aureus’ un kültürel ve moleküler teşhisi ve izolatların antibiyotik duyarlılıklarının belirlenmesi

Abstract

Çalışmada materyal olarak Balıkesir İlindeki bir süt işletmesinin 4 farklı sürüsünde bulunan toplam 305 adet sağmal inek, klinik olarak muayene edilmiştir. Hayvanların her meme lobundan ayrı olarak alınan toplam 1.220 adet süt örneği, California mastitis testiyle (CMT) test edilmiştir. CMT sonucunda 1, 2 ve 3 olarak skorlanan hayvanların ilgili meme loblarından laboratuvar alanalizleri için süt örnekleri alınmıştır. 107 (%8.77) adet örnek pozitif olarak değerlendirilmiştir. CMT pozitif 107 örnek, 100 adet hayvandan alınmıştır. CMT pozitif tüm örnekler, somatik hücre sayısı bakımından da analiz edilmiştir. Mastitis enfeksiyonu şüpheli sütler için somatik hücre sayımları (SHS) Bentley FTS/FCM Combi 400 Cihazı kullanılarak gerçekleştirildi. 200.000 hücre/mL'ye eşit veya daha yüksek sayımlar, yaygın olarak subklinik mastitisli hayvanların bir göstergesi olarak kabul edilmektedir. CMT pozitif sonuç veren toplam 107 adet süt örneği izolasyon amaçlı kullanılmıştır. Örnekler %7 koyun kanlı agara inoküle edilerek, 37℃’de ve arerobik koşullarda 1-3 gün inkübe edilmiştir. Aynı zamanda şüpheli örneklerden mannitol salt agar (MSA), Saboraud dextrose agar’a (SDA) ekimler yapıldı. MSA ve MacConkey agar’lar 37℃’de ve aerobik koşullarda 1-3 gün inkübe edilmiştir. SDA’a ekimler iki seri olarak yapılıp, bir seri 25℃’de diğer seri ise 37℃’de 7 gün inkübe edilmiştir. İnkübasyonu takiben kanlı agarda üreyen koloniler öncelikle makroskobik ve mikroskopik morfolojileri yönünden incelenmiştir. Gram pozitif koklar konvansiyonel testlerle identifiye edilmiştir. Bu amaçla katalaz, koagülaz, çeşitli karbonhidrat fermantasyon testleri, eskulin, indol, metil red, üre ve sitrat testleri gerçekleştirilmiştir. MSA ve MacConkey agara yapılan ekimlerde koloni morfolojisi dikkate alınmıştır. 107 süt numunesinden toplam 156 izolat elde edilmiştir. Miks olarak izole edilen izolat sayısı 83 (%53.20), saf kültür olarak izole edilen etken sayısı ise 73 (%46.79) olarak bulunmuştur. S. aureus dışında izole edilen türler Streptococus spp., E. coli, Bacillus spp. ve maya olarak identifiye edilmiştir. İzolatların Staphylococcus spp. olarak identifikasyonlarının doğrulanması amacıyla konvansiyonel PCR çalışması yapılmıştır. Bu amaçla cins spesifik primerler (756 bp) kullanılmıştır. Çalışmada kullanılan izolatların fenotipik olarak identifikasyonları sonucunda Staphyloccoccus spp. şüpheli izolatların tümü %100’ü S. aureus olarak identifiye edilmiştir. Tüm izolatların Staphylococcus spp. 16S rRNA (geni (756 bp) içerdiğinin belirlenmesiyle identifikasyon doğrulanmıştır. İzole edilen toplam 24 adet S. aures suşu brain heart infusion brothta (BHIB) (1.10493.0500, Merck) üretilip (McFarland No:0.5), Mueller-Hinton agar (MHA)’da (1.05437.0500, Merck) antibiyogram testi yapılmıştır. Test, Kirby-Bauer disk difüzyon yöntemine göre yapılmıştır (Bauer ve vd., 1966). Teste sefoperazon (75 μg, Oxoid), amoksisilin/klavulanik asit (20/10 μg, Oxoid), oksitetrasiklin (30 μg, Oxoid), penisilin G (10 μg, Oxoid), sulphametaxazole/trimethoprim (25 μg, Oxoid), enrofloksasin (5 µg, Oxoid), vankomisin (30 μg, Oxoid), gentamisin (10 µg, Oxoid), eritromisin (15 µg, Oxoid) ve sefalothin (30 µg, Oxoid) kullanılmıştır (CLSI, 2017). İzolatların antibiyotik duyarlılık testi sonucunda oluşan zon çapları CLSI (2019)’a uygun olarak değerlendirilmiştir. İzolatlar arasında, en yüksek direnç %80.76 (n=21) ile penisilin G’ye karşı olduğu, daha sonra sırası ile %73.07 (n=19) eritromisin, %65.38 (n=17) gentamisin, %46.15 (n=12) enrofloksasin ve %42.30 oksitetrasiklin (n=11) olarak belirlenmiştir. İzolatların en duyarlı olduğu antibiyotik %69.23 ile (n=18) sefoperazon olarak belirlenmiştir. Bunu sırasıyla %65.38 ile (n=17) sefalotin, %61.53 ile (n=16) amoksisilin/klavulanik asit, %53.84 ile (n=14) vankomisin ve trimetoprim/sulfametoksazol olarak belirlenmiştir. Çalışmada izole edilen 26 S. aureus suşunun 4 tanesinin (%15.38) çoklu antibiyotik direncine sahip olduğu tespit edilmiştir. Üç tane izolatın 3 farklı antibiyotik sınıfına, 1 izolatın ise 4 farklı antibiyotiğe dirençli olduğu belirlenmiştir. Toplam 22 izolatın ise çoklu antibiyotik direncine sahip olmadığı saptanmıştır.

In addition to S. aureus, the following species were identified: Streptococcus spp., E. coli, Bacillus spp. and yeast. A conventional PCR study was performed in order to confirm the identification of the isolates as Staphylococcus spp. For this purpose, genus-specific primers (756 bp) were used. As a result of the phenotypic identification of the isolates used in the study, 100% of all Staphylococcus spp. suspected isolates were identified as S. aureus. The identification of all isolates as Staphylococcus spp. was confirmed by determining the 16S rRNA (gene (756 bp) value. A total of 24 S. aures strains were isolated and produced (McFarland No: 0.5) in brain heart infusion broth (BHIB) (1.10493.0500, Merck) and an antibiogram test was performed on Mueller-Hinton agar (MHA) (1.05437.0500, Merck). The test was performed according to the Kirby-Bauer disk diffusion method (Bauer et al., 1966). The test was performed with cefoperazone (75 μg, Oxoid), amoxicillin/clavulanic acid (20/10 μg, Oxoid), oxytetracycline (30 μg, Oxoid), penicillin G (10 μg, Oxoid), sulfamethoxazole/trimethoprim (2 5 μg, Oxoid), enrofloxacin (5 μg, Oxoid), vancomycin (30 μg, Oxoid), gentamicin (10 μg, Oxoid), erythromycin (15 μg, Oxoid) and cephalothin (30 μg, Oxoid) were used (CLSI, 2017). The zone diameters of the isolates as a result of the antibiotic test were evaluated in accordance with CLSI (2019). The isolates exhibited varying degrees of resistance to the different antibiotics. The highest resistance was determined to be to penicillin G, with 80.76% (n=21) of the isolates being resistant. This was followed by erythromycin, with 73.07% (n=19) of the isolates being resistant. Other antibiotics that were effective against the isolates included gentamicin, with 65.38% (n=17) of the isolates being resistant, enrofloxacin, with 46.15% (n=12) of the isolates being resistant, and oxytetracycline, with 42.30% (n=11) of the isolates being resistant. The antibiotic to which the isolates demonstrated the greatest sensitivity was identified as cefoperazone, with 69.23% (n=18) of isolates exhibiting sensitivity to this agent. This was followed by cephalothin with 65.38% (n=17), amoxicillin/clavulanic acid with 61.53% (n=16), vancomycin and trimethoprim/sulfamethoxazole with 53.84% (n=14). It was determined that four of the 26 S. aureus waters isolated in the study (15.38%) exhibited multiple antibiotic resistance. Of the 3 isolates exhibiting resistance to three different antibiotic classes, one isolate demonstrated resistance to four different antibiotics. Concurrent studies are being conducted on a total of 22 isolates that do not demonstrate multiple antibiotic resistance.