Yenilebilir mantar türlerinden polifenol oksidaz enziminin saflaştırılması ve karakterizasyonu

Abstract

Bu çalışmada, enzimatik kararmaya neden olan polifenol oksidaz (PPO) ekstrakte edildi ve amonyum sülfat çöktürmesi, diyaliz ve Sepharose 4B-L-tirozin-paraaminobenzoik asid afinite kolonu ile saflaştırıldı. Enzim kaynağı olarak Lactarius salmonicolors ve Agaricus bisporus mantarları kullanıldı. Saflaştırılan enzimler için SDS-PAGE de tek bir bant elde edildi. Lactarius salmonicolor PPO (LsPPO) enziminin molekül ağırlığı 36 kDa, Agaricus bisporus PPO (AbPPO) enziminin molekül ağırlığı 50 kDa civarında gözlemlenmiştir. Katekol, 4-metil katekol ve pirogallol substratları kullanılarak, PPO enziminin optimum pH ve sıcaklık değerleri belirlendi. LsPPO enziminin kullanılan üç farklı substrat için optimum pH ve sıcaklıları sırasıyla pH 6.0-7.5 ve 0-25 oC arasında değiştiği bulunmuştur. Bu değerler AbPPO enzimi için ise pH 7.5-8.0 ve 20-30 oC arasında değiştiği bulunmuştur. Lactarius salmonicolor ve Agaricus bisporus PPO enzimlerinin optimum pH ve sıcaklıkta katekol, 4-metil katekol ve pirogallol substratları için KM ve Vmax değerleri Linewear-Burk yöntemi ile bulunmuştur. Vmax/ KM değerlerine göre LsPPO enzimi için en uygun substratın 4-metil katekol, AbPPO enzimi için ise pirogallol olduğu bulunmuştur. Glutatyon, L-sistein, p-aminobenzen sulfanamid, okzalik asit, 2-merkapto etanol, siyrincis asit ve L-tirozin' in AbPPO ve LsPPO aktivitesi üzerine inhibisyon etkisi katekol substratı kullanılarak etkisi incelendi. Kinetik çalışmalar 2-merkapto etanol, L-sistein, siyrincis asit, okzalik asit, glutatyon ve p-aminobenzen sülfanamidin LsPPO enziminin unkompetetif inhibiörü iken, L-tirozin kompetitif inhibitörü olduğunu göstermiştir. Kinetik çalışmalara göre 2-merkapto etanol, L-sistein, siyrincis asit ve L-tirozinn, AbPPO enziminin unkompetetif inhibitörü iken, p-aminobenzen sülfanamid karışık tipli ve okzalik asit ise kompetitif inhibitörüdür.

In this study polyphenol oxidase (PPO) which leads to undesirable enzymatic browning was extracted and purified through ammonium sulphate precipitation, dialysis and Sepharose 4B-L-tyrosin-paraaminobezoic acid affinity column. Lactarius volemus and Agaricus bisporus mushrooms are used as enzyme sources. The purified enzymes were migrated as a single band on SDS-PAGE. The molecular weight of the Lactarius salmonicolor PPO (LsPPO) enzyme and Agaricus bisporus PPO (AbPPO) enzyme were estimated respectively around 36 kDa and 50 kDa. Optimum pH and temperature values of PPO enzyme was determined using catechol, 4-methylcatechol and pyrogallol as substrate. The optimum pH and temperature values of LsPPO for the used three substrates ranged between the pH 6.0-7.5 and 25-0 oC. In the case of AbPPO, pH 7.5-8.0 and 20-30 oC values were obtained. The KM and Vmax values of Lactarius salmonicolor and Agaricus bisporus PPO towards catechol, 4-methylcatechol and pyrogallol were determined by Lineweaver Burk method. The values Vmax/KM showed that LsPPO has the greatest reactivity towards 4-metil catechol and AbPPO has the greatest reactivity towards pyrogallol among the substrates used. Effects of some classical PPO inhibitors of glutathione, L-Cysteine, p-aminobenzene sulfonamide, oxalic acid, 2-mercapto ethanol, syringic aci and L-tyrosine were investigated on the activity of AbPPO using as a catechol substrate. The kinetic analysis showed that 2-mercapto ethanol, L-cystein, syringic asid, oxalic acid, glutathione and p-aminobenzene sulfonamide were uncompetitive inhibitors of LsPPPO while L-tyrosine was acted as a competitive inhibitor of LsPPO enzyme. According to kinetic results, 2-merkapto etanol, L-cystein, syringic acid and L-tyrosine were uncompetitive inhibitor of AbPPO enzyme while p-aminobenzene sulfanamide was the mixed type of inhibitor and oxalic acid was as a competitive inhibitor of AbPPO enzyme.