Yeni bir antimikrobiyal tedavi yaklaşımı olarak insan serum paraoksonaz 1 enziminin kullanılması

Abstract

Son yıllarda laktonaz olarak da bilinen paraoksonaz enziminin bir çok patojen bakteri tarafından kullanılan sinyal moleküllerinin yıkımında rol alabileceği yapılan çalışmalarda gösterilmiştir. Bu amaçla çalışmamızda insan serum paraoksonaz 1 (PON1) enzimi, amonyum sülfat çöktürmesi ve hidrofobik etkileşim kromatografisi (Sepharose 4B-L-tyrosine-1-Naftilamin) yöntemleri kullanılarak saflaştırılmıştır. Saflaştırılmış enzim SDS-Poliakrilamid jel elektroforezinde yaklaşık 43kDa molekül ağırlığında tek bant vermiştir. Saflaştırılmış PON1 enziminin ticari olarak satın alınan N-hexa-L- homoserin lakton (C10-HSL) ve N-3-oxooktonoyil-L-homoserin lakton (3OC8-HSL) bileşikleri üzerindeki hidroliz etkisi HPLC analizleri ile gösterilmiştir. Sinyal moleküllerinin PON1 tarafından hidrolizinin Km ve Vmax değerleri tespit edilmiştir. Enzimin bu bileşikleri substrat olarak katalizlediği düşünülmektedir. Sırasıyla 3OC8HSL ve C10HSL için Km değerleri 2.714 mM ve 0.8 mM, Vmax değerleri 1428.57 U/ml dakika ve 45.24 U/ml dakika olarak hesaplanmıştır. PON1 enziminin artan konsantrasyonuna bağlı olarak Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae ve Staphylococcus aureus bakteri üremelerini azalttığı da tespit edilmiştir. Ortamda enzimin etki edeceği sinyal molekülü konsantrasyonunun bakteri konsantrasyonu ile doğru orantılı olduğu göz önüne alınırsa enzimin sinyal molekülünü hidrolizlemek suretiyle bakteri üremesini azalttığı düşünülmektedir. Quorum quenching ajanı olan PON1 enziminin birçok bakterinin türe özgü davranışlarından olan P. aeruginosa'nın biyofilm oluşumu üzerindeki etkisi incelenmiştir. PON1 enziminin laktonaz aktivitesi ile sinyal moleküllerini yıktığı düşünülerek bakteriler arası iletişim olan Quorum sensing inhibisyonuna neden olduğu yapmış olduğumuz çalışmalarda gösterilmiştir.

In the recent years, studies carried on by scientists showed that paraxonases enzymes, known as lactonase can play a role in degredation of signal molecules used by a number of pathogen bacteria. In our study to achieve this aim, human serum paraoksonaz1 (PON1) was purified by using ammonium sulfate precipitation and hydrophobic interaction chromatography (Sepharose 4B-L-tyrosine-1-Naftilamin). Purified enzyme was shown a single band with 43 kDa in SDS-polyacyrilamide gel electrophoresis. Hydolysis effect of purified PON1 enzyme was shown on the N-hexa-L- homoserine lactone (C10-HSL) and N-3-oxooctonoyl-L-homoserine lactone (3OC8-HSL) compounds that are commercial with HPLC analysis. The Km and Vmax values of hidrolysis effect of signal molecules by PON1 enzyme were determined. Enzyme was thought to catalyze these compounds as substrate. The Km values of 3OC8HSL and C10HSL were calculated as 2.714 mM ve 0.8 mM, Vmax values were calculated as 1428.57 U/ml min and 45.24 U/ml min, respectively. We determined that the reduction of Pseudomonas aeruginosa, Escherichia. coli, Klebsiella. pneumoniae ve Staphylococcus aureus bacterial reproduction according as increasing of PON1 enzyme concentration. Considering that signal molecule concentration that enzyme effects is parallel with bacterial concentration, bacteria reproduction is reduced by the enzyme hydrolizes the signal molecules. Effect of PON1 enzyme as Quorum quenching agent on P. aeruginosa biofilm formation which is various bacteria's actions belong to species was investigated. In this study, it is shown that PON1 enzyme via lactonase activity is responsible for inhibition of quorum sensing by hydrolyzes of signal molecules.