Zeytin tahmini tiyoredoksin geninin moleküler karakterizasyonu

Abstract

Bu çalışmada Ayvalık zeytin çeşidine (Olea europaea L. cv. Ayvalık) ait meyvesiz yapraklardan ele edilen cDNA kütüphanesine ait tahmini tiyoredoksin geninin moleküler analizi yapıldı. Tiyoredoksinler hücre redoks düzenlemesinde rol oynayan küçük proteinlerdir. Gelişmiş ökaryotlardan prokaryotlara kadar tüm organizmalarda mevcuttur. Tiyoredoksin disülfit oksidoredüktaz olarak hizmet eder. Çeşitli biyoinformatik araçlarla analiz edilen tiyoredoksin geninin 706 nükleotit uzunluğundaki mRNA' sının 188 aminoasit kodlayan bir açık okuma çerçevesi (ORF) bulundurduğu, moleküler ağırlığının 20944.94 Dalton olduğu tespit edildi. Genin kodladığı proteinin yüksek oranda serin aminoasidi bulundurmasına ilaveten diğer bitkilerin tiyoredoksinlerinin hiç birinde rastlanmayan 6 adet serin aminoasit tekrarı (SSSSSS) içerdiği tespit edildi. Tahmini tiyoredoksin geninin iki ekzon ve bir introndan oluşmakta olduğu bulundu. Zeytinde ilk defa uygulanan TAIL - PCR ile yaklaşık 650 nükleotitlik promotör bölgesi tespit edildi. Proteinin dokusal ve zamansal ekspresyon seviyesini belirlemek için 12 ay boyunca toplanan zeytin örneklerinden elde edilen RNA örnekleri ile anlık gösterimli (real - time) PCR yapıldı. Genin en çok meyvede sentezlendiği, aylara göre bakıldığında ise Kasım ayında oluşan olgun meyvede ekspresyon seviyesinin en yüksek olduğu saptandı. Tahmini tiyoredoksin geninin zeytindeki temel görevini öğrenmek için yapılacak protein ekspresyon deneylerinin ilk basamağı olan ekspresyon vektörüne klonlama işlemi gerçekleştirildi. Sonraki çalışmalarda ekspresyon vektöründen proteinin üretilmesi ve biyokimyasal karakterizasyonunun yapılmasının yanında, promotör bölgesinin tamamının tespit edilerek fonksiyonel promotör karakterizasyonunun yapılması planlanmıştır.

In this study, molecular analysis of a putative thioredoxin isolated from a cDNA library generated from olive (Olea europaea L. cv. Ayvalik) leaves in July, was performed. Thioredoxin is a small protein that functions in cellular redox regulations as a disulfide oxidoreductase in many organisms fromhigher eukaryotes to prokaryotes.. Bioinformatics analysis of the putative gene revealed about 706 nucleotides longmRNA that encodes a 188 amino acid long open reading frame (ORF) and a 20944.94 Dalton protein. The putative protein contains a high percentage of serine. Moreover the protein contains 6 amino acid repeat (SSSSSS) that was not detected in its homologs in other plants. The putative thioredoxin gene was found to be composed of two exons and one intron. TAIL - PCR in olive is applied for the first time and a putative promoter region of approximately 650 nucleotides was detected. Spatial and temporal expression of mRNA levels from olive tissue samples collected along 12 months were detected with the real - time PCR. According to the results the putative gene has sthe highest expression level in mature fruits. To explore the biochemical properties of the encoded protein, the cDNA was cloned into an expression vector. Studies to express the putative protein, and to obtain a more comphrehensive promoter region are underway.