İnsan serum paraoksonaz enziminin kitosan üzerine immoblizasyonu ve karakterizasyonu

Abstract

Paraoksonaz enziminin saflaştırılması için hidrofobik etkileşim kromatografisi jeli, CNBr ile aktive edilmiş Sepharose-4B'ye uzantı kolu olarak L-tirozin bağlandıktan sonra ligand olarak hidrofobik bir molekül olan 9-Aminofenantren'in L-tirozine kenetlenmesi reaksiyonu ile sentezlenmiştir. Hidrofobik etkileşim kromatografisi ve amonyum sülfat çöktürmesi yöntemleri ile paraoksonaz enzimi saflaştırılmıştır. Saflaştırılan paraoksonaz enzimi SDS poliakrilamid jel elektroforezine uygulanarak yaklaşık 65 kDa molekül ağırlığına sahip tek bant elde edilmiştir. Saflaştırılan paraoksonaz enzimi hidrofobik taşıyıcı olan Kitosan`na immobilize edilerek immobilize enzimin bağlanma yüzdesi % 68 ve katalatik etkinliği 3,2229 olarak bulunmuştur. Paraoksonaz saf ve immobilize formlarının paraokson substratına karşı Km ve Vmax değerleri Lineweaver-Burk yöntemi ile sırasıyla saf enzim için, 1,067 mM ve 125 U/mldakika olarak immobilize enzim için, 1,755 mM and 181 U/mldakika değerleri elde edilmiştir. Immobilize paraoksonaz enziminin enzimatik davranışları serbest enzim ile karşılaştırılmıştır. Serbest ve immobilize paraoksonaz benzer optimum sıcaklıklar (25-45 ºC) ve pH (7.0) değerleri göstermesine rağmen immobilize paraoksonazın daha uzun süre etki gösterdiği tespit edilmiştir. Ayrıca immobilize enzimin termal inaktivasyonu serbest enzime göre daha yavaş olduğu gözlemlenmiştir.

Because of purification of paraoxonase, hydrophobic interaction chromatography gel was synthesized with Sepharose-4B-L-tyrosine and 9-Aminofenantren as a hydrophobic ligand. Sepharose-4B was activated with CNBr and than L-tyrosine was added as an extension arm. Paraoxonase was purified with ammonium sulfate precipitation and hydrophobic interaction chromatography. SDS-polyacyrilamide gel electrophoresis showed a single band with 65 kDa. Purified paraoxonase was immobilized to Chitosan using as hydrophobic carrier and after immobilization, the yield of bound enzyme was found around % 68 and the catalytic efficiency was approximately 3,2229. The Km and Vmax values were determined of soluble and immobilized enzyme by the method of Lineweaver-Burk plots, using paraoxon as a substrate. The Km and Vmax of soluble enzyme was 1,067 mM and 125 U/mlmin. respectively, immobilized enzyme's Km and Vmax was 1,755 mM and 181 U/mlmin, respectively. The enzymatic properties of immobilized paraoxonase were compared with those of the soluble enzyme. Soluble and immobilized paraoxonase showed similar optimum temperature (25-45 ºC) and pH (7.0) values, but the duration of activitiy of the immobilized paraoxonase was longer. On thermal inactivation of immobilized paraoxonase was slower than the soluble enzyme.