Lactuca sativa L.'den elde edilen polifenoloksidazın kısmi karakterizasyonu

Abstract

Bu çalışmada, marul (Lactuca sativa L.) polifenol oksidaz (PFO) enziminin kısmi saflaştırılması yapılmış ve bazı kinetik özellikleri incelenmiştir. Lactuca sativa L.’den ekstrakte edilen polifenol oksidaz (NH4)2SO4 (amonyum sülfat) çöktürmesi ve diyaliz işlemleri sonucunda kısmi olarak saflaştırılmıştır. Lactuca sativa L.’nin toplam fenolik madde miktarı Folin-Ciocalteau metodu kullanılarak belirlenmiştir. Bu metoda dayanarak Lactuca sativa L.’de 100 g taze bitki için 304 mg fenolik madde içeriği tespit edilmiştir. Protein içeriği ise Bradford yöntemi kullanılarak tespit edilmiştir ve 100 g taze bitki için 494/mg mL olarak bulunmuştur. Ayrıca PFO’ın substrat spesifikliği, optimum pH ve sıcaklık değerleri ve ısı inaktivasyonu incelenmiştir. PFO aktivitesi L-tirozin, 4-metilkatekol, katekol ve pirogallol substartları kullanılarak incelenmiştir. Polifenol oksidaz aktivitesi 4- metilkatekol ve katekol için 420 nm’de, pirogallol için 320 nm’de ve L-tirozin 484 nm’de spektrofotometrik olarak ölçülmüştür. Diğer taraftan, Lactuca sativa L.’den elde edilen PFO, L-tirozine karşı aktivite göstermemiştir. Kinetik parametreler olan KM ve V max değerleri Lineweaver-Burk grafiğinden hesaplanmıştır. Enzimin katalizleme gücünü gösteren Vmax/ KM parametresine göre en iyi substrat pirogallol onu takiben katekol ve 4-metilkatekolün olduğu tespit edilmiştir. Lactuca sativa L. polifenoloksidazının optimum sıcaklık aktivite değerleri katekol için 40 0C, 4-metilkatekol ve pirogallol için 30 0C’de olduğu bulunmuştur. Marul PFO’ının optimum pH değerleri ise 4-metilkatekol, katekol ve pirogallol için sırasıyla 6.5, 8.0 ve 7.5 olarak saptanmıştır. Lactuca sativa L. PFO’nın 35 0C, 55 0C ve 75 0C’de ısı inaktivasyon çalışmaları 4-metilkatekol, katekol ve pirogallol substratları kullanılarak yapılmıştır. Özellikle 4-metilkatekol ve katekol substratları kullanıldığında artan inaktivasyon süresine paralel olarak PFO aktivitesinin belirgin şekilde azaldığı gözlenmiştir. Değişik inhibitörlerin maruldan kısmen saflaştırılan PFO aktivitesi üzerine etkisi, 4-metilkatekol, katekol ve pirogallol fenolik substratları kullanılarak spektrofotometrik olarak incelenmiştir. Bu amaçla, tropolon, glutatyon, askorbik asit, 4-aminobenzoik asit, sodyum azid ve benzoik asit inhibitörleri değişik konsantrasyonlarda kullanılarak Lactuca sativa L. PFO aktivitesi inhibe edilmeye çalışılmıştır. Fakat, sodyum azid ve benzoik asitle Lactuca sativa L.’den elde edilen PFO inhibe edilememiştir. Diğer taraftan daha önce belirtilen substratlar kullanılarak her bir inhibitör için inhibisyon mekanizması belirlenmiştir. Deneysel sonuçlara göre marul PFO’nun inhibisyonu için en güçlü inhibitörün glutatyon olduğunu göstermiştir.

In this study, polyphenol oxidase of lettuce ( Lactuca sativa L.) was partiallypurified and we investigated its some kinetic parametres. Polyphenol oxidase oflettuce (Lactuca sativa L.) was extracted and partially purified through ammoniumsulphate ( (NH4)2SO4 ) and dialysis.The total phenolic content of Lactuca sativa L. was determined according tothe Folin-Ciocalteu method. Total phenolic content was found to be 304 mg/ 100 gon a fresh weight basis. Protein content was determined according to Bradfordmethod and it was found to be 494 mg mL- for ever 100 g on a fresh weight .In addition it was investigated the effects of substrate specificity, pH,temperature and heat-inactivation on polyphenol oxidase. PPO activity wasdetermined using 4-methylcatechol, catechol, pyrogallol and L-tyrosine as substrates.Polyphenol oxidase activity was measured spectrophotometrically for 4-methylcathechol and catechol at 420 mn, for pyrogallol at 320 nm and for Ltyrosineat 484 mn. On the other hand, lettuce (Lactuca sativa L.) showed noactivity toward the L-tyrosine. Kinetic parametres, KM and Vmax , were calculatedfrom Lineweaver-Burk graph. According to Vmax/ KM parametres pyrogallol was thebest substrat, followed by catechol and 4-metyl catechol. The optimum temperaturevalues of Lactuca sativa L. polyphenol oxidase for catechol found to be 40 0C, for 4-methyl catechol and pyrogallol found to be 30 0C. The optimum pH values oflettuce PPO were 6.5, 8.0 and 7.5 for 4-methyl catechol, catechol and pyrogallol,respectively. Polyphenol oxidase of Lactuca sativa L.was investigated heatinactivationat 35 0C , 5 5 0C and 75 0C using 4-methylcatechol, catechol andpyrogallol as substrates. Especially, the enzyme activity decreased due to heatdenaturationof the enzyme with increasing temperature and inactivation time forcatechol and 4-methylcatechol substrates.The effect of different inhibitors on partially purified lettuce polyphenoloxidase activity was investigated by spectrophotometrically, using 4-methylcatechol, catechol and pyrogallol as phenolic substrates. For this purpose, tropolone,glutathione, ascorbic acid, 4-aminobenzoik acid, sodium azide and benzoic acid wereused to inhibit the activity of Lactuca sativa L. PPO at different concentrations.However, the presence of sodium azide and benzoic acid didin?t have inhibitor effecton the activity of Lactuca sativa L. polyphenol oxidase. On the other hand, it wasdetermined mechanism of inhibition for each inhibitor using sellected substrates.According the experimental results it can be said that glutathione was found to be themost potent inhibitor for Lactuca sativa L. polyphenol oxidase.