Paraksonaz enzimi kullanılarak transkripsiyonel aktivite belirlenmesinde yararlanılacak bir aday haberci sisteminin oluşturulması

Abstract

Paraoksonaz (PON) hem arilesteraz, hem de paraoksonaz (arildialkil fosfataz; E.C.3.1.8.1) aktivitesine sahip, karaciğerde sentezlenen bir serum estereazdır. Paraoksonaz gen ailesi; PON1, PON2 ve PON3 olmak üzere bilinen üç üyeye sahiptir. İnsan serum paraoksonazı (PON1), 43 kDA molekül ağırlığında 354 amino asitlik bir proteindir ve ailede en populer olan üyedir. Tezimizde amaçlanan transkripsiyonel aktivitenin belirlenmesinde kullanılacak alternatif bir salınan haberci sisteminin oluşturulmasıdır. Salınan haberci sistemlerin çalışma prensibinde temel olarak salınan haberci bir vektör bulunur. Bu vektör salınan lusiferaz geni ve onun üst kısmına promotor elementlerinin eklenmesine izin veren çoklu klonlama bölgesini (MCS) içerir. Salınan lusiferazın ekspresyonunu, ilgili promotor elementinin etkinliğini gösterir ve bu etkinlik tranfekte edilmiş hücrelerden alınan medyum örneğinden belirlenir. Çalışmamızda hedeflenen var olan sistemde kullanılan lusiferaz enzimi yerine paraoksonaz enziminin kullanımıdır. İlk olarak haberci vektörde bulunan lusiferaz geni kesilerek çıkartılmış ve yerine PON1 geni klonlanmıştır. Vektördeki promotor klonlamaları için uygun olan MCS bölgesine CAIX promotor bölgesi klonlanarak haberci vektör rekombinant hale getirilmiştir. Hepatoma hücre hattı olan Hep3B hücrelerine transfeksiyonlar yapılarak yeni oluşturulan sistemin aktivitesi belirlenmiştir. Ayrıca PON1 geninin protein analizleri SDS page ve western blot çalışmalarıyla tespit edilmiştir.

Paraoxonase (PON) has both arylesterase and paraoxonase activity that is synthesized in liver. The paraoxonase (PON) gene family contains three members PON1, PON2 and PON3. Human serum paraoxonase(PON1 ) is a protein of 354 amino acids with a molecular mass of 43 kDa and most popular member of the family. Aim of the our thesis is to generate a candidate secreted reporter system using paraoxonase enzyme for determination of transcriptional activity. There is a secreted reporter vector in the these secreted systems as a principle. These vectors contain a secreted lusiferace gene followed the multiple cloning site (MCS) used for the cloning of the promoter elements. Expression of the secreted lusiferace indicates the activation of the promoter elements and can be determined from the samples collected from the culture mediums. The purpose of the this study is to use paraoxonase enzyme instead of lusiferace enzyme. First of all, the luciferace gene is removed from the vector by resriction digestion and PON1 gene was cloned. The vector has recombined by cloning of the CAIX promoter to the MCS site of the vector, activation of the novel system is tested by transfections to the hepatoma cell line, Hep3B. Protein analysis of the PON1 was also done by SDS PAGE and western blot analysis.