Karbonik anhidraz izoenzimlerinin saflaştırılması için yeni bir afinite jelinin sentezlenmesi

Abstract

Bu çalışmada, tüm canlılarda bulunan ve solunum sisteminin önemli enzimlerinden biri olan karbonik anhidraz enzimi insan eritrositlerinden saflaştırılmıştır. Proteinlerin saflaştırılmasında en kolay ve kullanışlı bir teknik olan afinite kromatografisi kullanılmıştır. Çalışmamızda matriks olarak kullanılan Sepharose-4B’ye hiçbir uzantı kolu bağlanmadan sülfonamid türevi olan 4-(6-amino-hekziloksi)-benzensülfonamid, ligand olarak bağlanıp yeni bir afinite jeli sentezlenmiştir. Sentezlenen yeni afinite jeli, Sepharose-4B-4-(6-amino-hekziloksi)-benzensülfonamid kullanılarak hCA-I ve hCA-II izoenzimleri saflaştırılmıştır. Saflaştırma sonunda elde edilen hCA-I izoenzimi için verim ve saflaştırma derecesi sırasıyla % 81.3 ve 65.1 kat; hCA-II izoenzimi için verim ve saflaştırma derecesi sırasıyla % 97.8 ve 97.8 kat olarak bulunmuştur. Sentezlenen yeni afinite jelinin en uygun çalıştığı pH, sıcaklık ve iyonik şiddet değerleri, her bir CA izoenzimi için bulunmuştur. hCA-I ve hCA-II izoenzimleri için en uygun koşullar pH: 8.5, 25°C, 0.1 iyonik şiddeti olarak tespit edilmiştir. CA izoenzimlerinin elüsyonu için ise en uygun çözelti hCA-I için 50 mM Na2HPO4 / 1 M NaCl, pH: 6.3 ve hCA-II içinde 50 mM Na2HPO4 / 0.2 M KSCN, pH: 6.3 olarak belirlenmiştir. Elde edilen her CA izoenziminin saflığı, Sodyum Dodesil Sülfat Poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ile kontrol edilmiştir.

In this study, Carbonic anhydrase enzyme which is ubiquitously found in all kingdoms of life and one of the most important enzyme of the respiratory system was purified from human erythrocytes. Affinity chromatography which is the easiest and the most practical technique was used. A new affinity gel was prepared on a Sepharose-4B matrix which is activated by CNBr, followed by reaction with the CA inhibitor 4-(6-amino-hexyloxy)-benzenesulfonamide as a ligand was bound to activated matrix without using any spacer arm. Using newly synthesised affinity gel Sepharose-4B-4-(6-amino-hexyloxy)-benzenesulfonamide, both carbonic anhydrase isoenzymes hCA-I and hCA-II were purified. The overall purification and yield for hCA-I were % 81.3 and 65.1-fold; for hCA-II were % 97.8 and 97.8-fold, respectively. The binding capacity of the new affinity gel was determined at different temperatures, pH values, ionic strengths and elution buffers. The maximum binding of hCA-I and hCA-II were achieved at 25°C with pH 8.5 and ionic strength around 0.1. The most convenient elution buffer for hCA-I was 50 mM Na2HPO4 / 1 M NaCl, pH: 6.3 and 50 mM Na2HPO4 / 0,2 M KSCN, pH: 6.3 for hCA-II. The purity of the enzymes was controlled by SDS–polyacrylamide gel electrophoresis.