Laktoperoksidaz enziminin saflaştırılması ve bazı bileşiklerin bu enzim üzerine etkilerinin araştırılması

Abstract

Laktoperoksidaz (LPO) enzimi (E.C.1.11.1.7) memelilerin sütünde, gözyaşında ve tükürüğünde bulunan, prostetik grup olarak hem grubu içeren bir glikoproteindir. Bu çalışmada sığır laktoperoksidaz (LPO) enzimini saflaştırmak için yeni bir afinite jeli sentezlendi. CNBr ile aktive edilmiş Sepharose-4B matriksi üzerine uzantı kolu olarak etilendiamin bağlandı ve ligand olarak enzimin inhibitörü olan 4-izotiyosiyonat benzen sulfonamid kullanıldı. Sentezlenen bu afinite jeli ile sığır sütünden LPO enzimi saflaştırılmıştır. Enzimin saflığı SDS-PAGE ile kontrol edilmiş ve 80 kDa civarında tek bant elde edilmiştir. Saf enzimin kinetik sabitleri (KM ve Vmax) Lineweaver-Burk yöntemi ile saptanmıştır. KM ve Vmax değerleri sırasıyla 1,4 mM ve 1000 U/mLdak. olarak belirlenmiştir. Farklı iyonik şiddet, pH ve sıcaklıklarda kolon şartları incelenmiştir. Bu çalışmalar sonucunda optimum şartlar şu şekilde belirlenmiştir; iyonik şiddet için dengeleme ve yıkama tamponunda Na2SO4 içermeyen, bağlanmanın en iyi olduğu pH 6 ve sıcaklık 25°C olarak belirlenmiştir.. Bazı veteriner ilaçları ve tarımda kullanılan bazı pestisitlerin enzim üzerindeki etkileri incelenmiş, inhibisyon gösteren bileşikler için IC50 değerleri saptanmıştır. Bu değerlere bakıldığında, pestisitlerin ve veteriner ilaçları türevlerinin tamamı LPO enzimini inhibe ettiği gözlenmiştir.

Lactoperoxidase (LPO; E.C.1.11.1.7) is a glycoprotein which presents in mammalian milk, tear, and saliva, which contains prosthetic heme group. In this study, a new affinity gel was synthesized to purify bovine lactoperoxidase (LPO) enzyme. Ethylenediamine was bound to CNBr-activated Sepharose-4B matrix as a spacer arm, and 4-izotiyosiyonat benzenesulfonamide which is an inhibitor of the enzyme was used as ligand. LPO enzyme was purified from the bovine milk by this affinity gel. The purity of the enzyme was checked by Sodium Dodesyl Sulfate Polyacrilamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) and a single band around 80 kDa was obtained. The kinetic constants of the pure enzyme (KM and Vmax) were calculated by Lineweaver-Burk method. KM and Vmax values were determined as 1,4 mM and 1000 U/mLdak., respectively. Column conditions were investigated in the different ionic strength, pH and temperature. As a result of these studies, optimum column conditions were detected as follows; for the ionic strength, the best binding values were detected as pH 6 and 25 °C for the Na2SO4 free equilibration and washing buffers. The effects on the enzyme of some veterinary medicine and pesticides used in agriculture were examined and IC50 values were determined for the compounds which show inhibition effect. When we consider these values, It is observed that all of the pesticides and the derivatives of the veterinary medicines inhibited the LPO enzyme.