Maya karbonik anhidrazının ekspresyonu, saflaştırılması, elektroforetik ve kinetik özelliklerinin incelenmesi

Abstract

Karbonik anhidraz (CA, EC 4.2.1.1) CO2 molekülünün hidratasyonunu ve HCO3- iyonunun dehidratasyonunu katalizleyen, Zn2+ iyonu içeren bir metaloenzimdir. Bütün bilinen CA’lar α, β, γ, δ ve ε-CA olmak üzere beş CA gen ailesi olarak sınıflandırılmıştır. Maya CA enziminin de ait olduğu β-CA sınıfının izoformları, yüksek bitkilerde ve siyanobakterileri de içeren alglerde yaygındır. β-CA’lar genellikle 2-6 monomerden oluşan oligomerlerdir. Bu çalışmada, bazı klinik sülfonamitlerin Maya CA üzerinde inhibisyon etkileri araştırılmıştır. Bu amaçla maya genomik DNA’sı izole edilerek PCR’a dayalı teknik ile NCE103 geni çoğaltılmıştır. Bu gen pGEM-T vektörüne ve daha sonra pET21a ekspresyon vektörüne klonlanmıştır. Maya CA enziminin ekspresyonu E.coli BL21(DE3) içerisinde gerçekleştirilmiştir. Hücre ekstraktından Maya CA enzimi Jel Filtrasyon Kromatografisi ile saflaştırılmış ve enzimin saflığı Sodyum Dodesil Sülfat Poliakrilamit Jel Elektroforezi (SDSPAGE) ile tespit edilmiştir. Enzim aktivitesi ve inhibisyon çalışmaları Stop-Flow cihazı ile yapılmıştır. Klinik amaçlı kullanılan 15 farklı sülfonamit türevlerinin Maya CA’ya karşı inhibisyon etkileri incelenmiştir. Bu amaçla her bir bileşik için IC50 (%50 inhibisyona neden olan inhibitör konsantrasyonu) değeri saptanmıştır. Bu değerler sırasıyla; Asetazolamit için 8.27x10-8 M, Metazolamid için 8.61 x 10-6 M, Etokszolamid için 5.41 x 10-6 M, Diklorfenamid için 5.73 x 10-6 M, Dorzolamid için 7.35 x 10-6 M, Brinzolamid için 7.58 x 10-6 M, Benzolamid için 7.37 x 10-6 M, Topiramat için 7.35 x 10-6 M, Sulpirid için 8.74 x 10-6 M, İndisulam için 8.93 x 10-6 M, Zonisamid için 6.29 x 10-6 M, Valdekoksib için 1.04 x 10-5 M, Selekoksib için 7.41 x 10-6 M, Sulthiam için 1.51 x 10-5 M, Sakarin için 6.43 x 10-4 M olarak tespit edilmiştir.

Carbonic anhydrase (CA, EC 4.2.1.1) is a Zn2+ containig metalloenzyme which catalyses the reversible hydration of CO2 to the bicarbonate ion. All known CAs can be grouped in five evolutionarily unrelated CA families designated α-, β-, γ-, δ-, ε-CA. β-CAs, in which yeast CA belongs, are common in higher plants and algae including cyanobacteria. β-CAs are usually oligomers, generally formed of two to six monomers. In this study the inhibition effects of some clinical sulfonamides on yeast CA were investigated. For this purpose yeast genomic DNA was isolated and NCE103 gene was amplified by PCR based strategy. NCE103 gene was cloned into pGEM-T vector and subsequently into pET21a expression vector. The exypression of yeast CA was performed in E.coli BL21(DE3). Yeast CA was purified by Gell Filtration Chromatography. The purity of enzyme was determined by Sodium Dodesyl Sulfate Polyacrilamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE). Enzyme activity and inhibition studies were performed by Stop Flow spectrophotometer. The inhibition effects of 15 clinicaly used sulfonamides on yeast CA were investigated. Inhibition for yeast CA was calculated as IC50 value. IC50 values were determined as 8.27x10-8 M (mol/L) for Acetazolamide, 8.61 x 10-6 M for Metazolamide, 5.41 x 10-6 M for Ethoxzolamide, 5.73 x 10-6 M for Dichlorophenamide, 7.35 x 10-6 M for Dorzolamide, 7.58 x 10-6 M for Brinzolamide, 7.37 x 10-6 M for Benzolamide, 7.35 x 10-6 M for Topiramate, 8.74 x 10-6 M for Sulpiride, 8.93 x 10-6 M for İndisulam, 6.29 x 10-6 M for Zonisamide, 1.04 x 10-5 M for Valdecoxib, 7.41 x 10-6 M for Selecoxib, 1.51 x 10-5 M for Sulthiame and 6.43 x 10-4 M for Saccharin respectively.