Bazı sitokinlerin insan kolon kanseri hücrelerinde CAIX ifade düzeylerine etkilerinin belirlenmesi

Abstract

Karbonik anhidrazlar (CA), karbon dioksitin hidratasyonunu geri dönüşümlü olarak katalize ederler. Transmembran protein CAIX, CA ailesinin tümörle ilişkili bir üyesidir. CAIX ekspresyonu, bazı tümör hücreleri oldukça yüksek ekspresyon düzeyinde iken, normal dokularda oldukça sınırlıdır. CAIX, hipoksi, malin hücre invazyonu ve hücre proliferasyonunun regülasyonunda önemli rol oynarlar. Bu çalışmada, farklı konsantrasyonlarda TNFα, TGFβ, IL1α ve bu sitokinlerin ikili kombinasyonları uygulanmış HT-29 kolon karsinoma hücrelerinde CAIX protein ve mRNA ekspresyon seviyeleri araştırılmıştır. CAIX protein ekspresyonu, CAIX-FITC monoklonal antikor kullanılarak akış sitometrisinde saptanmıştır ve “gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu”, mRNA ekspresyon seviyeleri için kullanılmıştır. Buna ilaveten, bu sitokinlerin etkisi, HT–29 hücrelerinde akış sitometri kullanılarak, propidyum iyodid ile hücre döngüsü, “AnnexinV-FITC apoptozis saptama kiti” ile hücre canlılığı, nekroz ve apoptozis, araştırılmıştır. TNFα uygulanmış HT–29 hücreleri, kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, mRNA ve protein seviyesinde CAIX ekspresyonunda, zamana bağlı olarak istatistiksel olarak önemli bir azalışa neden olmuştur. TNFα,-IL1α, TNFα-TGFβ ikili kombinasyonları, HT–29 hücrelerinde sinerjistik etkiyle CAIX ekspresyon seviyesinde daha fazla bir düşüşe sebep olmuştur. Buna ilaveten, tek başına TNFα ve kombinasyonlarının hücre döngüsü analizi, hücrelerin G0/G1 tutuklandıklarını ve hücre canlılığında azalış, hücre nekrozunda artışı göstermiştir. Diğer taraftan, TGFβ uygulaması, CAIX protein ve mRNA seviyesinde artışla sonuçlanmıştır. Fakat hücre döngüsü, hücre canlılığı ve nekroz/apoptozis üzerinde bir değişim gözlenmemiştir. Benzer şekilde, IL1α ve IL1α-TGFβ kombinasyonu uygulanmış HT–29 hücrelerinde CAIX ekspresyonu ve hücre döngüsü analizinde anlamlı bir etki bulunmamıştır.

The carbonic anhydrases (CAs) catalyze the reversible hydration of carbon dioxide. CAIX, transmembrane protein is a tumor associated member of the CA family. CAIX expression is very limited in normal tissue whereas some tumor cells exhibit very high expression. CAIX play important roles in hypoxia, malignant cell invasion and the regulation of cell proliferation. In this study the CAIX protein and mRNA expression levels in HT–29 colon carcinoma cells treated with different concentrations of TNFα, TGFβ, IL1α and double combinations of these cytokines were investigated. CA IX protein expression was detected by CAIX-FITC monoclonal antibody by flow cytometry and Real time Polymerase Chain Reation was used for mRNA expression levels. In addition, the effect of these cytokines was investigated in cell cycle by propidium iodide, cell viability, necrosis and apoptosis by “AnnexinV-FITC apoptosis detection kit” in using flow cytometry in HT–29 cells. TNFα led to statistically significant decrease in CAIX expresion protein and mRNA level in time-dependent manner in HT–29 cells compared to control cells. Double combinations of TNFα/IL1α and TNFα/TGFβ caused more decrease in CAIX expression level suggesting their synergistic effect in HT–29 cells. In addition, cell cycle analysis of TNFα in single and combinations showed G0/G1 arrest and decrease of cell viability, the increase cell necrosis. On the otherhand, TGFβ result in increase in CAIX mRNA level and protein level but no change in cell cycle, cell viability and necrosis/apoptozis. Similarly, no significant effect in CAIX expression and cell cycle analysis was observed in IL1α and combinations of IL1α/TGFβ treated HT–29 cell.