Zeytinde polen uyumunu kontrol eden aday genin moleküler karakterizasyonu

Abstract

Bu çalışmada zeytin cDNA kütüphanesinden edinilen bir tam uzunluktaki cDNA dizisinin moleküler analizi, çeşitli biyoinformatik araçlar ve çeşitli moleküler biyolojik yöntemler kullanılarak yapıldı. Bu işlemler sonucu bu genin yapısı ve işlevi aydınlatılmaya çalışıldı. Bu çalışmada gene özgü tasarlanan primerlerle PZR amplifikasyonu yapıldıve gen bölgesi çoğaltıldı. Böylelikle tam uzunukta gen molekülleri elde edildi. Gen dizisi genom veri tabanlarında taratıldığında, Miyozin Ağır Zincir Kinaz B, E3 Ubiquitin Ligaz, WD40 Tekrarları İçeren Proteine ve Bitkisel Uyuşmazlık Geni gibi farklı genlere benzerlik gösterdiği saptandı. Genin daha sonra yine gene özgü tasarlanan primerlerle 23 zeytin çeşidinde polimorfizm çalışması yapıldı. Genin polimorfik bölgeler içerdiği saptandı. Zeytinin çeşitli dokularından, belirli periyotlarla toplanan örneklerle kantitatif gerçek zamanlı PZR (qRT-PCR)analizi yapıldı ve bu işlemlerin sonucu grafiğe döküldü. Gen tasarlanılan His-Tag kuyruklu aLICator primerleri ile tekrar amplifiye edilip, pLATE51 vektörüne klonlandı. IPTG ile indüklenen gen ekspre edildi ve protein saflaştırması yapıldı. Saflaştırma sonucu elde edilen proteinlerin biyo ölçümlerinin yapılması amacıyla SDS- PAGE ve Western Blot analizleri gerçekleştirildi.

In this study, was made molecular characterization of a full lenght cDNA utilizing bioinformatic tools and molecular biology experiments. Results of these studies provided information about structure and functions of WD40 repeat containing gene. Firstly, PCR had conducted with gene spesific primers, thus a full-lenght cDNA was obtained along with a full length gDNA clone. Then the gene was scanned at BlastN (non-redundant NCBI database), which showed similarity to different genes like myosin heavy chain kinase B gene, WD40 domain F- Box protein in Sessamum inducum, vegetative incompatiblty gene in Solanum tuberosum, and E3 ubiquitin ligase gene in A.thaliana. Afterwords, polymorphism analysis was performed among 23 olive cultivars, and polymorphic regions were dedected. The gene expression level was analysed in different tissues of olive. With His-Taq tail aLICator primers were designed for cloning. The cloning was carried out into pLATE51 vector. Also, transformation was made in order to express protein in E.coli DH10B and in E.coli DE3 through inducing with IPTG that expressed targeted protein. After protein prufication was made, SDS-PAGE and Western blot analyses were conducted.