NonO/p54nrb promotorunun klonlanması ve fonksiyonel analizi

Abstract

NonO/p54nrb (Non-POU domain içeren octamer bağlanma protein), insanlarda NONO geni olarak kodlanan bir proteindir ve SFPQ, SPI1 ve androjen reseptörleri ile etkileşimi gösterilmiştir. Son zamanlarda NonO/p54nrb'nin paraspeckles olarak adlandırılan yeni bir nükleer domainin bileşeni olduğu belirtilmiştir. Paraspeckles memeli hücrelerinin interkromatin bölgesinde bulunan alt nükleer gövdelerin nispeten yeni bir sınıfıdır. Böylece paraspeckles ve onun bileşenleri farklılaşma, viral enfeksiyon ve stres cevapları dahil olmak üzere birçok hücresel işlemler sırasında gen ekspresyonunun kontrolünde bir role sahiptir. Ayrıca NonO/p54nrb transkripsiyonun başlamasında, RNA işlenmesinde, transkripsiyonun uzaması, sonlanması dahil olmak üzere nukleus içerisinde çeşitli işlemlere katılmaktadır. Bununla birlikte NonO/p54nrb'nin transkripsiyonel regülasyonu hakkında sınırlı bilgi bulunmaktadır. Çalışmamızda prostat kanser modeli (PC3) ve normal endotel hücrelerinde bu genin hipoksik regülasyonu analiz edilmiştir. İlk olarak on farklı hücre hattında (Hela, HUVEC, HT-29, MCF-7, PC3, Du145, Hep3B, Panc, Saos, Mg63) NonO/p54nrb'nin ekspresyon profili belirlenmiştir. Kimyasal olarak CoCl2 ile uyarılmış hipoksik model kullanılmıştır. Hipoksiya sqRT-PCR kullanılarak HIF-1α mRNA seviyeleri ile doğrulanmıştır. mRNA seviyesindeki NonO/p54nrb gen ekspresyonu, protein ve transkripsiyonel aktivite seviyeleri analiz edilmiştir. NonO/p54nrb farklı promotor parçaları (P1: -730/+529, P2: -516/+529, P3: -336/+529, P4: -159/+529) pMetLuc lusiferaz vektör içerisine klonlanmıştır. Bazal promotor aktivitesi geçici tranfeksiyon deneyleri ile belirlenmiştir. Parçaların bazal aktivitesi 48 saatteki hipoksiyada artmıştır. NonO/p54nrb mRNA ve protein seviyeleri 72 saatteki hipoksiya tarafından uyarılmıştır. Buna ek olarak EMSA ile promotordaki olası HIF-1α bağlanma bölgesi (+471/+529 bç) gösterilmek için çalışılmıştır.

NonO/p54nrb (Non-POU domain-containing octamer-binding protein) is a protein that in humans is encoded by the NONO gene and has been shown to interact with SFPQ, SPI1 and Androgen receptor. NonO/p54nrb was recently shown to be a component of a novel nuclear domain termed paraspeckle. Paraspeckles are a relatively new class of subnuclear bodies found in the interchromatin space of mammalian cells. Paraspeckles and their components may ultimately have a role in controlling gene expression during many cellular processes including differentiation, viral infection, and stress responses. Additionaly, NonO/p54nrb participate in numerous processes within the nucleus, including transcription initiation, RNA processing, transcription elongation, and termination. However there is limited information about the transcriptional regulation of NonO/p54nrb. We analyzed the hypoxic regulation of this gene in prostate cancer model (PC3) and normal endothelial cells (HUVEC). Fisrtly, we determined the expression profile of NonO/p54nrb in ten different cell lines (Hela, HUVEC, HT-29, MCF-7, PC3, Du145, Hep3B, Panc, Saos, Mg63). We used chemically induced hypoxic model using CoCl2. Hypoxia was confirmed by HIF1α mRNA level using sqRT-PCR. We analyzed NonO/p54nrb gene expression at mRNA, protein and transcriptional activity level. We cloned different NonO/p54nrb promoter constructs (P1: -730/+529, P2: -516/+529, P3: -336/+529, P4: -159/+529) into pMetLuc lusiferase vector. Basal promotor activity were determined by transient transfection assays. Basal activity of constructs increased in hypoxia at 48 h. NonO/p54nrb mRNA and protein levels were induced by hypoxia at 72 h. Additionaly, we tried to show the possible HIF-1α binding site (+471/+529 bp) in the promoter with EMSA.