İnsan karbonik anhidraz III geninin transkripsiyonel regülasyonu

Abstract

Karbonik anhidraz ailesinin üyesi olan, İnsan Karbonik Anhidraz III (CAIII) geni, ailenin diğer üyelerinden farklı olarak düşük hidratize yapma, sülfanamid inhibitörlerine direnç gösterme ve esteraz aktivitesine sahiptir. Literatürde hakkında çok az bilgi bulunan CAIII geni başta iskelet kasında olmak üzere rahim, mesane, prostat, akciğer, karaciğer, kalp kası, mide ve bağırsakta ifade olan bir gendir. Bu tez kapsamında CAIII’ün transkripsiyonel regülasyonu aydınlatılmıştır. Biyoinformatik analizler kapsamında insan, fare ve sıçanın promotor bölgeleri kıyaslanmıştır. İnsan CAIII promotoruna ait dizi klonlanarak gen bankasına MF374499 erişim koduyla kayıt ettirilmiştir. CAIII promotoruna ait 4 farklı kısaltılarak yapılan delesyon promotor konstrağı (P1 -941/+86, P2 -699/+86, P3 -236/+86 ve P4 -108/+86 ) oluşturulmuştur. Geçici transfeksiyon deneylerinde, insan osteosarkom hücre modelinde (Saos-2) hücrelerinde tüm promotor parçalarının aktif olduğu ve en yüksek aktiviteyi P4 -108/+86 promotor parçasının gösterdiği belirlenmiştrir. Biyoinformatik analizler CAIII promotorunda olası SP1, C/EBP ve USF bağlanma bölgelerini taşıdığını göstermiştir. Promotor parçaları SP1, C/EBPα ve USF1 transkripsiyon faktörleri ile ektopik ekspresyonu CAIII transkripsyonel seviyesini arttıdığı tespit edilmiştir. Ayrıca, SP1, C/EBP ve USF transkripsiyon faktörlerinin ektopik ifadesi, CAIII mRNA ve protein düzeyinde arttığı da qRT-PCR ve western blot ile gösterilmiştir. EMSA deneyleri ve yarışma deneyleri ile SP1, C/EBPα ve USF1, promotorda farklı bölgelere bağlandığı belirlenmiştir. Prostat kanser modelinde kimyasal indüklenmiş hipoksik modelde, CAIII’ün ekspresyon seviyesini mRNA ve protein seviyenin arttığı belirlenmiştir. Ayrıca -941/ +86 ve -699/ +86 promotorlarında transkripsiyonel aktivitede artış tespit edilmiştir. Bu artışın ise CAIII -268/-252 Bölgesinde bulunan HIF-1’in bağlandığı HRE bölgesinin sorumlu olabileceği belirlenmiştir. Son olarak ektopik CAIII cDNA ekspresyonunun prostat kanser hücrelerindeki etkisi belirlenmiştir. PC3 hücrelerinde ektopik olarak verilen CAIII cDNA’sının hücrelerin apoptotik, metastatik ve proliferatif karakterine etkileri belirlenmiştir.

The Human Carbonic Anhydrase III gene that is a member of the carbonic anhydrase family has low hydratase activity, esterase activity and, resistance to sulphanamide inhibitors, unlike other members of the family. CAIII that has very little information in the literature is widely expressed in the uterus, bladder, prostate, lung, liver, heart, stomach and intestine, mainly in the skeleton. In this thesis, the transcriptional regulation of CAIII has been elucidated. Within the context of bioinformatics analysis, the promoter regions of human, mouse and rat were compared. The sequence of the human CAIII promoter was cloned and registered with the accession code MF374499 to the gene bank. Four different truncated deletion promoter constructs (P1 -941 / + 86, P2 -699 / +86, P3 -236/ +86 and P4 -108 / +86) of the CAIII were generated. In transient transfection experiments, it was determined that all promoter fragments in the human osteosarcoma cell model (Saos-2) cells were active and that the highest activity was exhibited by the P4 -108 /+86 promoter fragment. Bioinformatics assays have shown that they carry possible numerous SP1, C/EBP and USF binding sites in the CAIII promoter. Ectopic expression with SP1, C/EBPα and USF1 transcription factors led to increase the transcriptional level of CAIII. Similarly, ectopic expression of SP1, C/EBP and USF transcription factors increased in CAIII mRNA and protein levels shown by qRT-PCR and western blot. EMSA and Competition experiments experiments revealed that SP1, C/EBPα and USF1 bind different regions of the promoter. In the chemically induced hypoxic model in the prostate cancer model, mRNA and protein level of CAIII was increased The transcriptional activity of promoter -941 / +86 and -699 / +86 regions were also increased in the case of hypoxia. The increase of trancriptional activity of CAIII promoter was resulted from HRE region that is a target of HIF-1 transcription factors CAIII -268 / -252 promoter. Finally, the effect of ectopic CAIII cDNA expression in prostate cancer cells was determined. The effects of CAIII cDNA, ectopically given in PC3 cells, on the apoptotic and proliferative characteristics of the cells have been determined.