Endemik Salvia huberi hedge türünün polifenol oksidaz aktivitesi

Abstract

Bu çalışmada Salvia huberi HEDGE’den elde edilen polifenol oksidazın (PFO) kısmi karakterizasyonu yapılmıştır. PFO, Salvia huberi L.’den ekstrakte edilerek amonyum sülfat çöktürmesi ((NH4)2SO4) ve diyaliz yoluyla kısmen saflaştırılmıştır. PFO’nun katalizleme gücünü ve substrat spesifikliğini belirlemek üzere katekol, 4-metil katekol ve pirogallol kullanılmıştır. Enzimin optimum pH , sıcaklık ve konsantrasyonu belirlenmiştir. Ayrıca glutatyon ve askorbik asit kullanılarak inhibisyon tipleri belirlenmeye çalışılmıştır. Salvia huberi HEDGE’nin Bradford yöntemi kullanılarak protein içeriği tespit edilmiştir. PFO; katekol, 4-metil katekol ve pirogallol substratlarına karşı aktivite göstermiştir. Enzimin katalizleme gücünü gösteren Vmax/KM değerine göre en iyi substratın pirogallol olduğu ve bunu sırasıyla katekol ve 4-metil katekolün izlediği gözlemlenmiştir. Optimum pH değerlerinin sırasıyla katekol, 4-metil katekol ve pirogallol substratları için 7.5, 5.0 ve 7.5 olduğu bulunmuştur. Optimum sıcaklık değerleri katekol substratı için 10, 4-metil katekol substratı için 25 ve pirogallol substratı için 35 ºC olduğu belirlenmiştir. Optimum tampon konsantrasyonu değerleri katekol, 4-metil katekol ve pirogallol substratı için sırasıyla 60 mM, 100 mM ve 10 mM olduğu tespit edilmiştir. Bradford metoduna göre belirlenen toplam ham protein içeriğinin ise 930 µg/mL-1 olduğu belirlenmiştir. Substrat olarak katekol ve pirogallol kullanıldığında en etkin inhibitörün askorbik asit, substrat olarak 4-metil katekol kullanıldığında en etkin inhibitörün glutatyon olduğu bulunmuştur.

In this study, partial characterization of polyphenol oxidase (PPO) extracted from Salvia huberi HEDGE was performed. PPO was partially purified by ammonium sulphate ((NH4)2SO4) precipitation and dialysis methods after being extracted from Salvia huberi L. In order to determine the specificity of substrate and catalysis, catechol, 4-methyl catechol and pyrogallol were used. Optimum pH, temperature and concentrations were determined. In addition, inhibition types were determined by glutathion and ascorbic acid. The protein content of Salvia huberi L. was also determined by Bradford method. PFO showed enzyme activities against catechol, 4-methyl catechol and pyrogallol substrates. According to Vmax/KM values, representing the power of enzyme catalysis, it was observed that the best substrate was pyrogallol followed by catechol and 4-methyl catechol. Optimum pH values were found as 7.5, 5.0 and 7.5 for catechol, 4- methyl catechol and pyrogallol, respectively. Optimum temperatures were found as 10 ºC for catechol, 25 ºC for 4-methyl catechol and 35 ºC for pyrogallol. Optimum buffer concentrations were determined as 60 mM, 100 mM and 10 mM for catechol, 4- methyl catechol and pyrogallol, respectively. According to the Bradford assay results, total protein content was found as 930 µg/ mL-1. It was found the most effective inhibitor ascorbic acid using as substrate pyrogallol and catechol, the most effective inhibitor glutatyone using as substrate 4-methyl catechol.