ß-glukozidaz enziminin hidrofobik etkileşim kromatografisi ile Olea Europea meyvesinden saflaştırılması, karakterizasyonu ile bazı pestisit ve ağır metallere karşı afinitesinin araştırılması

Abstract

Bu çalışmada, önemli fonksiyonlarda görev alan ß-glukosidaz enzimi, zeytin meyvesinden yeni bir yöntemle saflaştırılmıştır. Saflaştırma işleminde önce amonyum sülfat çöktürmesi ardından hidrofobik etkileşim kromatografisi metodları kullanılmıştır. Çalışmamızda zeytin ß-glukosidaz enzimi %54.9 verimle 154.8 kat saflaştırılmıştır. Saflaştırılan zeytin beta-glukosidaz enziminin SDS poliakrilamid jel elektroforezinde yaklaşık 65kDa molekül ağırlığında tek bant şeklinde görüntülenmiştir. Zeytin beta-glukosidaz enziminin substrat spesifikliği pNPG, oNPG, pNPGal ve oNPGal substratları kullanılarak belirlenmiştir. Söz konusu enzimin KM değeri 2.22 mM, ve Vmax değeri 370.37 EU olmak üzere pNPG subtratına diğerlerİne göre ilgisinin daha fazla olduğu tespit edilmiştir. Beta-glukosidaz enzimlerinin genel inhibitörlerinden glukoz ve δ-glukonolaktonun, saflaştırılmış zeytin beta-glukosidaz enzimi üzerindeki etkileri incelenmiştir. Her iki bileşiğin enzim aktivitesi üzerinde kompetitif inhibisyon etkisi gösterdiği belirlenmiştir. Ayrıca zeytin tarımında yaygın kullanılan diazinon, deltamethrin ve glyphosat pestisitlerinin saflaştırılmış zeytin beta-glukosidaz enzimi üzerindeki etkileri araştırılmıştır. Bu pestisitlerden Glyphosatın enzim aktivitesini arttırdığı ve diazinon ile deltamethrinin de enzimi kompetitif olarak inhibe ettiği tespit edilmiştir. Doğada sık karşılaşılan ağır metallerden Ag, Fe, Ni, Cd, Cu ve Pb'nun saflaştırılmış zeytin ß-glukosidaz enzim aktivitesi üzerine in vitro etkileri araştırılmıştır. Bu ağır metallerden Fe'in enzim aktivitesi üzerinde aktivasyon etkisi gösterdiği belirlenmiştir. Ancak Cu, Ag, Ni, Cd ve Pb ağır metallerinin ise enzim aktivitesi üzerinde inhibisyon etkisi gösterdiği tespit edilmiştir. Ayrıca çalışmamızda inhibisyon etkisi gösteren ağır metallerin inhibisyon etki mekanizmaları da belirlenmiştir.

In this study, ß-glucosidase enzyme which play important roles was purified from olive fruit by means a new method. In purification process firstly the ammonium sulfate precipitation, secondly hydrophobic interactions chromatography method were used. In our study, olive ß-glucosidase enzyme was purified 154.8 fold with 54.9% yields. The purified olive beta-glucosidase enzyme, was observed as a single band as approximately 65kDa molecular weight with SDS polyacrylamide gel elektrophoresis. The specificity of olive beta-glucosidase enzyme was determined used pNPG, oNPG, pNPGal and oNPGal substrates. It was determined that the enzyme had more affinity to pNPG substrate with Km value of 2.22mM and Vmax value of 370 EU. The effects of general inhibitors of ß-glucosidase enzme which are glucose and δ-glukolakton, were investigated on olive ß -glucosidase enzyme. It was determined that both compound have competitive inhibition effect on purified enzyme activity. In addition, the effects of diazinon, deltamethrin and glyphosate pesticides which are commonly used in olive agriculture were investigated on olive beta-glucosidase. It was determined that from this pesticides glyphosate increased enzyme activity and diazinon and deltametrin inhibited the activity by means of competitive inhibition. The effects of Ag, Fe, Ni, Cd, Cu and Pb which are commonly seen heavy metals in the nature on purified beta-glucosidase enzyme was investigated in vitro. It was determined that from this heavy metals Fe has affected as activation on ezyme activity. However, it was determined that the other heavy metals Ag, Ni, Cd, Cu and Pb have inhbition effects on enzyme activity.