Bir perisentromerik adaptör proteini olan şugoşinin mayoz bölünme sırasında oluşan silici perisentromerik krosoverları nasıl engellediğinin araştırılması

Abstract

Hücre bölünmesi esnasında kromozomlar yeni oluşan hücrelere doğru biçimde paylaştırılmalıdır. Çünkü, bölünme esnasında oluşabilecek hatalar, Down sendromu gibi doğumsal hasarlarda görülen anöploidiye sebep olabilirler. Bu çalışmada, bir perisentromerik adaptör protein olan şugoşinin (Sgo1), kardeş kromatid kohesyonuna hasar verebilen ve anöploidi riskini arttırabilen silici perisentromerik krosoverların önlemesindeki rolünün ve mekanizmasının araştırılması amaçlanmıştır. Basit ökaryotik organizmalarda bile dikkat çekici bir şekilde evrimsel olarak moleküler düzeyde korunan kromozom ayrılma mekanizmaları hakkında temel bilgiler elde etmek için, deneysel olarak izlenebilir maya hücreleri (Saccharomyces cerevisiae) model sistem olarak kullanılmıştır. Sgo1 ve efektör proteinlerin perisentromerik krosoverları önlemedeki rolünü araştırmak için, klonlama yöntemleri ve genetik analizler kullanılarak hedef geni susturulan ve/ veya istenilen mutasyonlara sahip suşların oluşturulmasından sonra floresan krosover haberci testi gerçekleştirilmiştir. Protein komplekslerinin perisentromerik lokalizasyonlarının analiz edilmesi için Sgo1 sekansında nokta mutasyonları oluşturulmuş (D519N ve P390H) iki farklı suş kullanılarak kromatin immünopresipitasyonu gerçekleştirilmiştir. Mitoz ve mayoz sırasında komplekslerin perisentromere çekilme sürecinin de tespiti floresanlı canlı hücre görüntülemeleri ile sağlanmıştır. Bu çalışmanın sonuçlarına göre, Sgo1'in efektör proteini olan protein fosfataz 2A'yı perisentromere çekerek perisentromerik krosoverları önlediği ve her ikisinin de erken mayoz bölünmede eksprese edildikleri belirlenmiştir. Sgo1’in diğer efektör proteinlerinin (kondensin ve/ veya Aurora-B gibi) perisentromerik krosover önlemedeki rolleri bulunamamıştır ama incelenen iki farklı nokta mutasyonunun Sgo1'in sentromerik lokalizasyonunun bozulmasına sebep olduğu deşifre edilmiştir. Ayrıca Sgo1'in, perisentromerik krosoverları bir kohesin ayırma faktörü olan Rad61 / Wpl1'e karşı koyarak önlemediği sonucuna da ulaşılmıştır.

Chromosomes must be accurately partitioned to daughter cells during cell division because errors in this process cause aneuploidy seen in birth defects like Down’s Syndrome. This study aims to understand the role and mechanisms of the pericentromeric adaptor protein, shugoshin (Sgo1), to prevent deleterious pericentromeric crossovers which can cause disturbance in sister chromatid cohesion and an increased risk of aneuploidy. To gain fundamental insight into mechanisms of chromosome segregation which are remarkably conserved, even in simple eukaryotic organisms at the molecular level, the experimentally tractable yeast (Saccharomyces cerevisiae) was used as a model system. To investigate the role of Sgo1 and effector proteins to prevent pericentromeric crossovers, fluorescent crossover reporter assay was used after development of yeasts with target gene knockout and/ or mutations by using cloning methods and genetic analyses. Chromatin immunoprecipitation was performed to analyze recruitment of protein complexes to the pericentromere using two different strains with point mutations in Sgo1 sequence (D519N and P390H). Fluorescent live cell imagings were also done to monitor recruitment of complexes to the pericentromere during mitosis and meiosis. According to the results, it was concluded that Sgo1 prevents pericentromeric crossovers by recruiting its effector protein protein phosphatase 2A to the pericentromere and it was determined that they are both expressed in early meiosis I. Although the exact mutation in Sgo1 causing a defect only recruiting other possible effector proteins like condensin and/or Aurora-B to centromere couldn’t be found, it was deciphered that two different point mutations studied here caused a disrupted localization of Sgo1 to centromere. It was also observed that Sgo1 does not prevent pericentromeric crossovers by counteracting the cohesin removal factor, Rad61/Wpl1.