Frequently isolated slow growing nontuberculous mycobacteria from pulmonary samples and evaluation of drug susceptibility testing results in a referral hospital in Turkey

Abstract

Most of the nontuberculous mycobacteria (NTM) are opportunistic pathogenic microorganisms and free-living in nature. NTM can cause a wide range of infections. However, pulmonary NTM disease is the most frequent clinical picture. The aim of this study was to identify and evaluate drug susceptibility of slow growing NTM isolated from pulmonary samples of patients prediagnosed as tuberculosis between 2014 and 2018 in Ataturk Chest Diseases and Chest Surgery Training and Research Hospital Microbiology Laboratory by a commercial microtube dilution plaque method. A total of 435 NTM strains obtained from suspected TB patients were included in the study. After the samples were processed by homogenization and decontamination and acid-fast staining, culture in two solid media (Lowenstein-Jensen, Ogawa) and in MGIT-BACTEC960 automated system were performed. Acid-fast bacilli isolated from culture media were identified by using cart test (MPB64, Capilla TB-Neo) and polymerase chain reaction (PCR) based reverse hybridization "line probe assay (LPA)" method (GenoType MycobacteriumCM/AS, Hain Lifescience, GmbH, Germany). After DNA isolation from the culture, PCR was performed by using the primers specific for mycobacterial 23S rRNA spacer region. PCR products were then hybridized with the probes specific for Mycobacterium species on nitrocellulose strips according to the recommendations of the manufacturer and the results were evaluated. In this study, Mycobacterium avium (n= 77, 17.7%), Mycobacterium intracellulare (n= 70, 16.1%), Mycobacterium szulgai (n= 19, 4.4%), Mycobacterium kansasii (n= 10, 2.3%) ve Mycobacterium smiae (n= 9, 2.1%) were isolated as slowly growing mycobacteria from the pulmonary patients. Susceptibility testing was performed in cation-adjusted Mueller-Hinton broth (CAMH), supplemented with "oleic acid, albumin dextrose catalase" according to CLSI/M24-A2 guideline recommendations. For the antibiotic susceptibility test, ready-to-use plaque drugs for slow-growing mycobacteria (SLOMYCO-Sensititre, TREK Diagnostic Systems Ltd, UK), were used. M.intracellulare, M.avium, M.kansasii and M.smiae isolates were found to be sensitive to clarithromycin %100, %99, %100 and %100, respectively. For M.intracellulare and M.avium isolates, moxifloxacin and linezolid sensitivity values were found to be 91 %, 64% and 80%, 74% respectively. M.kansasii isolates were more sensitive than M.simiae isolates to the most of the drugs. M.kansasii isolates, were susceptible to rifabutin, rifampin, moxifloxacin, amikacin, linezolid, trimethoprim-sulfamethoxazole (TMP-SMX), ciprofloxacin and etambutol, with the frequencies of 100%, 90%, 100%, 100%, 80%, 70% and 50%, respectively. The study showed that the species identification and drug susceptibility testing of frequently isolated slow-growing NTM's from pulmonary specimens could guide for the treatment.

Tüberküloz dışı mikobakteri (TDM)’lerin çoğu doğada serbest yaşayan ve fırsatçı patojen mikroorganizmalardır. TDM’ler çok çeşitli enfeksiyonlara neden olabilirler. Ancak bunlar arasında en sık görülen klinik tablo pulmoner TDM hastalığıdır. Bu çalışmada, Atatürk Göğüs Hastalıkları ve Göğüs Cerrahisi Eğitim ve Araştırma Hastanesi Mikrobiyoloji Laboratuvarında 2014 ve 2018 tarihleri arasında tüberküloz (TB) ön tanısı alan kişilere ait hasta örneklerinden izole edilen yavaş üreyen TDM izolatlarının tanımlanması ve ticari mikrodilüsyon plak yöntemiyle ilaç duyarlılıklarının değerlendirilmesi amaçlanmıştır. Çalışmaya akciğer TB şüpheli hastalardan elde edilen toplam 435 adet TDM izolatı dahil edilmiştir. Örneklere homojenizasyon ve dekontaminasyon işlemi uygulandıktan sonra aside dirençli boyamanın ardından otomatize MGIT-BACTEC960 sistemi ve iki farklı katı besiyerinde (Löwenstein Jensen ve Ogawa) kültürü yapılarak aside dirençli bakteri (ARB) araştırılmıştır. Kültürden izole edilen ARB pozitif bakteriler kart testi (MPB64, Capilla TB-Neo) ve polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) temelli ters hibridizasyon “line probe assay (LPA)” (GenoType MycobacteriumCM/AS Hain Lifescience, Almanya) yöntemiyle tanımlanmıştır. Kültürlerden DNA izolasyonu yapıldıktan sonra, mikobakteri 23S rRNA “spacer” bölgesine özgü primerler kullanılarak PCR yöntemi uygulanmıştır. Elde edilen biyotinlenmiş PCR ürünü, nitroselülöz şeritler üzerinde mikobakteri türlerine özgü problarla üretici firmanın önerilerine göre hibridize edilerek değerlendirilmiştir. Bu çalışmada akciğer hastalarından sırasıyla Mycobacterium avium (n= 77, %17.7), Mycobacterium intracellulare (n= 70, %16.1), Mycobacterium szulgai (n= 19, %4.4), Mycobacterium kansasii (n= 10, %2.3) ve Mycobacterium smiae (n= 9, %2.1) yavaş üreyen mikobakteri türleri saptanmıştır. İlaç duyarlılık testinde CLSI tarafından CLSI/M24-A2 rehberi ile önerilen “oleic asit, albumin dextrose catalase” ile zenginleştirilmiş, katyon-ayarlı Mueller-Hinton (CAMH) sıvı besiyerinde mikrodilüsyon yöntemi kullanılmıştır. Test, kullanıma hazır ticari ilaçlı plaklarda (SLOMYCO-Sensititre, TREK Diagnostic Systems Ltd, Birleşik Krallık) yapılmıştır. M.intracellulare, M.avium, M.kansasii ve M.smiae’nın klaritromisine duyarlılıkları sırasıyla %100, %99, %100 ve %100 oranlarında saptanmıştır. M.intracellulare ve M.avium için moksifloksasine duyarlılık sırasıyla %91, %64 ve linezolide ise %80, %74 olarak bulunmuştur. M.kansasii, M.simiae’den daha fazla oranda birçok ilaca duyarlı bulunmuştur. M.kansasii’nin rifabutin, rifampisin, moksifoksasin, amikasin, linezolid, trimetoprim-sülfametoksazol (TMP-SMZ), siprofloksasin ve etambutole duyarlılığı sırasıyla %100, %90, %100, %100, %100, %80, %70 ve %50 oranlarında bulunmuştur. Bu çalışma, akciğer örneklerinden sık izole edilen yavaş üreyen TDM’lerin tür ayrımı ve ilaç duyarlılık testleri ile tedaviye rehberlik edebileceğini göstermiştir.